开发针对艰难梭菌毒素B亚型的广谱肽葡萄糖转移酶抑制剂

《Biotechnology and Bioengineering》：Development of Peptide Glucosyltransferase Inhibitors With Comprehensive Coverage Across Clostridioides difficile Toxin B Sub-Types

艰难梭菌感染由TcdA和TcdB毒素介导，传统抗生素易引发耐药性。本研究通过理性设计开发新型肽抑制剂靶向TcdB的葡萄糖基转移酶活性，利用微流控筛选和分子动力学模拟优化肽序列，发现SB5、SB2、SB6等肽能非竞争性抑制UDP-葡萄糖结合，竞争性阻断Rho蛋白结合，显著降低毒素活性。体内实验表明这些肽可维持肠道上皮细胞屏障功能并减少凋亡，为协同抗生素治疗提供新策略。

　　C. difficile感染正成为临床治疗中日益严峻的挑战，主要是由于耐抗生素和高毒力菌株的广泛传播。这种病原体引发的主要症状，包括结肠炎和腹泻，是由两种毒素TcdA和TcdB的释放所导致的。因此，针对这些毒素开发抑制剂成为了极具前景的治疗策略，既可以单独使用，也可以与标准抗生素治疗协同作用，以缓解严重症状并降低耐药性发展的风险。本研究中，我们展示了通过理性设计和优化获得的高效TcdB肽抑制剂，这些抑制剂能够有效抑制TcdB的糖基转移酶活性，从而阻止疾病症状的发生。此外，我们还通过详细的酶学研究，揭示了TcdB糖基转移酶域（GTD）对不同底物，如UDP-葡萄糖和Rho蛋白，表现出不同的米氏常数（Km）。所选的肽显示出对三种最常见的TcdB亚型的强大抑制效果，而这三种亚型占据了临床分离株中90%以上。同时，这些肽在人结肠上皮单层模型中显示出能够延缓TcdB引起的屏障完整性丧失并减少细胞凋亡的能力。这些发现为开发新的C. difficile感染治疗手段提供了重要线索。

C. difficile感染（CDI）是肠道疾病的重要病因之一，具有较高的发病率和死亡率，对医疗系统构成了沉重负担。目前的治疗指南建议停止引起肠道菌群失调的抗生素治疗，并开始针对C. difficile的特定抗生素治疗，如万古霉素或fidaxomicin。然而，这些方法并非总能有效，且可能导致感染复发、抗生素耐药性以及肠道菌群恢复延迟等问题。粪菌移植（FMT）作为一种替代方案，旨在通过引入健康供体的粪便物质或微生物群落来促进肠道菌群的恢复。尽管FMT被认为相对安全和有效，但在其来源、制造和储存方面仍存在挑战，并且对其长期疗效和作用机制仍有许多未解之谜。由于毒素的产生是CDI的关键环节，因此研究如何针对这些毒素开发新的治疗策略，成为了一个重要的研究方向。这不仅能够作为抗生素的补充治疗手段，还能与肠道菌群恢复疗法协同作用，从而提高治疗效果。

TcdA和TcdB是两种主要的C. difficile毒素，它们具有42%的序列同源性和60%的相似性。这两种毒素的结构和功能已经被大量研究揭示，但到目前为止，仅有Bezlotoxumab这一种毒素抑制剂获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。Bezlotoxumab是一种全人源单克隆抗体，它通过结合TcdB的CROPs结构域，阻止其通过CSPG4受体进入细胞。然而，另一种针对TcdA的抗体Actoxumab并未显示出任何治疗效果，且在临床试验中被放弃。因此，针对糖基转移酶活性的抑制可能比阻止细胞进入更具吸引力，因为这不需要干扰多个受体结合位点。此外，一些TcdB变体在这些结合位点上存在广泛的残基变化，使得它们能够逃逸中和作用，从而降低了Bezlotoxumab对某些变体的抑制效果，甚至完全逃逸了某些高毒力菌株的中和。这些发现强调了开发针对糖基转移酶活性的抑制剂的必要性。

在本研究中，我们采用了新的方法，通过设计肽抑制剂来靶向TcdA和TcdB的糖基转移酶活性。为了验证这一方法的可行性，我们利用了之前在TcdA抑制剂开发中所获得的经验，并结合了多种技术手段，包括固相肽库筛选、计算建模、分子动力学模拟以及人结肠上皮单层模型测试。首先，我们通过固相肽库筛选，获得了多个可能的候选肽，这些肽能够有效结合到TcdB的糖基转移酶活性位点。在筛选过程中，我们观察到某些特定的氨基酸残基，如精氨酸（R）、谷氨酰胺（Q）和脯氨酸（P），在这些候选肽中具有显著的富集。这些氨基酸能够通过静电相互作用、氢键、疏水作用和π-π堆叠等方式与糖基转移酶活性位点发生作用，从而提高其结合亲和力。

随后，我们利用计算方法对这些候选肽的结合亲和力进行了评估。通过分子对接和分子动力学模拟，我们发现某些肽在结合到TcdB1糖基转移酶域时表现出更强的结合能力。我们进一步对这些肽进行了优化，通过调整其氨基酸组成和构象，使其能够更有效地结合到目标位点。这些优化后的肽不仅在体外实验中表现出良好的糖基转移酶抑制效果，还在人结肠上皮模型中显示出能够延缓毒素引起的细胞毒性、维持细胞屏障完整性以及减少细胞凋亡的能力。这一结果表明，这些肽在体内可能具有显著的治疗潜力。

值得注意的是，虽然这些肽表现出对TcdB糖基转移酶活性的抑制作用，但它们的抑制效果在不同亚型之间存在差异。例如，SB5在三种主要TcdB亚型（B1、B2和B3）中表现出最一致的抑制效果，而SB2和SB6则在B3亚型中显示出较低的活性。这可能是由于B3亚型在某些关键区域（如反应环）存在不同的氨基酸变化，从而影响了这些肽的结合能力。此外，我们还发现，这些肽的结合能力与其水合特性密切相关。例如，Case 2的肽具有较高的水合能力，从而在体外实验中表现出更强的抑制效果。这一发现为未来开发更高效的糖基转移酶抑制剂提供了重要的线索。

为了进一步验证这些肽的作用机制，我们还通过氢-氘交换质谱（HDX-MS）技术对SB5的结合位点进行了定位。HDX-MS结果显示，SB5能够结合到TcdB1的反应环以及Rho蛋白结合界面，从而阻止Rho蛋白的结合。这一结果与我们之前的计算模型预测一致，进一步支持了这些肽通过直接竞争Rho蛋白来抑制糖基转移酶活性的机制。此外，我们还发现，SB5在结合后能够引起TcdB1的构象变化，使其更加暴露于溶剂中，从而影响其活性。这些结果表明，这些肽不仅能够有效结合到目标位点，还能够通过改变毒素的构象来降低其毒性。

在体外实验中，这些肽显示出对TcdB1、B2和B3糖基转移酶活性的显著抑制效果。通过测量透射电位（TEER）和细胞凋亡标记物（如cleaved-caspase 3）的表达，我们发现这些肽能够有效延缓毒素引起的细胞屏障功能破坏，并减少细胞凋亡。这一结果表明，这些肽在维持细胞结构完整性方面具有重要作用。此外，我们还发现，某些肽（如SB7）虽然在体外实验中表现出较低的抑制效果，但在人结肠上皮模型中却未能显著延缓细胞屏障功能的破坏。这可能是由于这些肽在体外实验中表现出的结合能力不足以在体内发挥作用，或者它们在细胞内的渗透能力有限。

综上所述，本研究通过理性设计和优化，成功开发出一系列能够有效抑制TcdB糖基转移酶活性的肽抑制剂。这些抑制剂不仅在体外实验中表现出良好的抑制效果，还在人结肠上皮模型中显示出延缓毒素引起的细胞毒性作用。这些结果为未来开发针对C. difficile感染的新型治疗手段提供了重要的理论基础和技术支持。尽管目前这些肽的结合能力仍然有限，但它们的发现为未来的药物开发提供了新的方向。此外，这些肽的结合机制和水合特性也为优化其结合能力提供了重要的参考。未来的研究可以进一步探索如何通过调整这些肽的结构或引入更稳定的骨架（如环状肽或小蛋白支架）来提高其结合能力，从而实现更广泛的临床应用。