综述：环境因素和文化条件对受控环境下本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中重组蛋白瞬时表达的影响

《Plant Biotechnology Journal》：The Impacts of Environmental Factors and Culture Conditions on the Transient Expression of Recombinant Protein in Nicotiana benthamiana Under Controlled Environments

植物分子养殖中环境调控与瞬时表达系统的优化研究，探讨了光照、温度、种植密度等条件对重组蛋白产量的影响。发现叶温、ER应激及氧化损伤是限制产量的关键因素，调控光照周期与CO2浓度可提升生物量积累，而降低温度或补充维生素C可有效缓解坏死反应。离体叶片系统因操作简便成为潜在解决方案。摘要：基于 Nicotiana benthamiana 的植物分子养殖研究，系统分析了预转基因（如光周期调控、高密度种植）和 пост转基因阶段（温度敏感性、叶温差异、氧化应激管理）的环境因素对重组蛋白产量的协同作用，提出需综合调控光质、光强、温湿度和营养条件以实现稳定高效生产，并论证了离体叶片系统的工业化可行性。

　　在植物中表达重组蛋白，尤其是用于生物制药的植物分子农场（Plant Molecular Farming, PMF）技术，近年来得到了广泛的研究和应用。其中，烟草植物（*Nicotiana benthamiana*）因其对病毒载体的高度敏感性，成为研究的首选宿主植物之一。通过瞬时基因表达平台，如使用*Agrobacterium tumefaciens*或植物病毒作为载体，可以实现快速且高效的重组蛋白生产。随着PMP（植物制造的药物）在动物和人类中的成功应用，研究重点已从“能生产什么”转向“如何高效地生产”，并进一步关注生产过程中环境因素和栽培条件对产量和质量的影响。

在植物表达系统中，植物的生长状态直接影响最终的蛋白产量。研究表明，植物在基因转移前的生长条件对其后续的蛋白表达能力具有显著影响。例如，增加光合光子通量密度（PPFD）或每日光积分（DLI）可以促进植物的生物量积累，从而提升目标蛋白的产量。这一现象在多个研究中得到验证，如Matsuda等人（2019）通过改变空气温度和PPFD，发现植物在基因转移前的生物量积累与后续的蛋白产量呈正相关。此外，植物的生长密度也对生物量积累和蛋白产量产生影响。高密度种植虽然可以提高单位面积的产量，但也可能导致叶片间相互遮挡，从而影响光合作用效率。因此，如何在高密度种植与光合作用效率之间找到平衡，成为优化生产条件的重要课题。

为了实现稳定且高效的蛋白生产，严格控制植物的生长环境是关键。植物工厂（Plant Factory with Artificial Lighting, PFALs）和温室（Greenhouse, GH）等封闭式栽培系统，为PMP生产提供了理想的环境。这些系统不仅可以防止转基因植物的基因扩散，还能减少外部病原体和害虫的污染，同时减少农药的使用。此外，它们还能稳定植物的生长条件，避免季节性气候波动对产量的影响。例如，Kn?dler等人（2019）在温室条件下研究了季节变化对DFE蛋白（一种结合HIV中和抗体和荧光蛋白的融合蛋白）产量的影响，发现温室中的产量波动比在植物工厂中更大。因此，植物工厂等严格控制环境的系统，可能更有利于实现稳定的蛋白产量。

在基因转移后的阶段，环境因素对蛋白积累的影响同样显著。叶片温度（*T*_leaf）是影响目标蛋白积累的关键变量之一。虽然空气温度（*T*_air）通常被作为调控参数，但叶片温度可能与空气温度存在差异，因为叶片的温度受到能量平衡的影响，包括短波和长波辐射、蒸腾作用等。例如，Matsuda等人（2018）发现，使用magnICON载体表达HA蛋白后，叶片温度上升可能与气孔关闭有关，而气孔关闭会减少蒸腾作用，进而影响叶片的温度调节。此外，当空气温度高于或低于最佳范围时，目标蛋白的积累可能受到影响。在某些情况下，温度的轻微下降可以有效减少叶片坏死现象，从而避免目标蛋白的降解。

叶片坏死是基因转移后常见的问题之一，可能由内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）应激引发，随后导致氧化应激。ER应激通常发生在蛋白质折叠和加工过程中，当内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质积累超过其处理能力时，会触发应激反应，进而影响植物的正常生理功能。这种应激反应可能通过生成活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）导致程序性细胞死亡。例如，Matoba等人（2010）和Pruksarojanakul等人（2025）的研究表明，降低空气温度可以减轻叶片坏死的严重程度，从而提高目标蛋白的稳定性。此外，应用抗坏血酸（Ascorbic Acid, AsA）也被证明可以有效抑制叶片坏死，提高蛋白产量。

光照条件在基因转移后的阶段同样具有重要影响。虽然光照对蛋白积累的促进作用已被广泛研究，但不同光谱和光照时间的组合可能对蛋白表达产生不同的效果。例如，Zhang等人（2025）发现，使用红光和远红光（R + FR）照射植物，在基因转移后能够促进GFP蛋白的积累，尽管植物的生物量有所减少。这种现象可能与光合作用的调控有关，因为光合作用的下降可能使植物将更多资源用于蛋白合成。然而，对于不同蛋白和不同载体系统，光照的影响可能存在差异。例如，Fujiuchi等人（2021）发现，光照在基因转移后的前半段可能对蛋白积累更为关键，而后续阶段的光照需求可能较低。此外，Bilotta等人（2024）的研究表明，关闭灯光的最后2-4天可能导致HA蛋白浓度下降40%-60%。因此，光照的强度和时间安排需要根据具体的蛋白种类和表达系统进行优化。

为了进一步提高PMF的生产效率，研究者们也探索了使用分离叶片的生产系统。与整个植株相比，分离叶片系统具有更易操作和更灵活的生产优势，尤其是在扩大生产规模时。然而，分离叶片系统的蛋白表达水平通常低于整个植株的表达水平，这可能与叶片的生理状态有关。例如，Plesha等人（2007, 2009）提出了一种两步法，即在基因转移后先通过低湿度条件去除叶片细胞间隙中的水分，再通过高湿度条件防止叶片萎蔫。这种策略有助于提高蛋白表达水平，使其接近整个植株的表达效率。此外，分离叶片系统可能更适合实现均匀的基因转移，从而提高蛋白的表达一致性。

在实际应用中，PMF技术面临的挑战包括如何在不同生产条件下优化蛋白产量，以及如何在保证产量的同时确保蛋白的质量。目前，大多数研究集中在产量的优化上，但对蛋白质量的影响研究仍显不足。例如，蛋白的糖基化模式、折叠状态和稳定性等，都可能受到植物生长条件的影响。因此，未来的研究应更加关注这些质量相关因素，以确保PMP作为生物制药的适用性。

此外，PMF技术的可持续性也是一个重要议题。由于植物工厂需要大量的电能用于照明和温度控制，如何提高能源使用效率，减少对化石燃料的依赖，成为研究的热点。利用植物的自养特性，如通过光合作用提供能量，可以降低对人工能源的依赖。同时，优化栽培系统，如采用更节能的照明技术或智能温控系统，有助于提高整体生产效率。在长期发展中，如何将不同栽培系统（如植物工厂、温室和露天田间）结合起来，以实现高效、可持续的PMP生产，也是值得进一步探索的方向。

综上所述，植物分子农场技术在生物制药领域的应用前景广阔，但其成功依赖于对环境和栽培条件的精确调控。从基因转移前的植物生长优化到基因转移后的温度、光照和湿度管理，每一个环节都可能影响最终的蛋白产量和质量。未来的研究需要更加系统地分析这些因素之间的相互作用，以实现更高水平的生产效率和稳定性。同时，推动PMF技术的标准化和规模化，也是实现其商业化应用的关键。