在电子传递链中存在的一种额外残留物，是实现类似动物的隐花色素（cryptochrome）的双重功能的关键

《Journal of Biological Chemistry》：An extra residue in the electron transfer chain holds the key for the dual functions of an animal-like cryptochrome

CraCRY通过电子传递链中Y373和N395残基的红ox状态调控实现光控二聚化和双功能转换，还原环境促进DNA修复活性，而氧化环境驱动生物钟调控功能，光解过程伴随结构重塑。

　　本研究聚焦于一种在藻类和真菌中发现的特殊光敏蛋白——CraCRY，该蛋白具有光修复酶和调控昼夜节律的双重功能。这种双重功能在动物界的光敏蛋白中并不常见，而CraCRY作为类动物的光敏蛋白，其功能机制和结构变化对于理解光敏蛋白的进化和功能多样性具有重要意义。研究通过稳态吸收光谱分析、有限蛋白酶解、突变分析以及功能实验等多种手段，揭示了CraCRY在光诱导下的反应机制，特别是Y373和N395这两个关键残基在电子传递链中的作用，以及它们如何影响蛋白的构象变化、二聚化和双重功能的实现。

### 光诱导下的反应机制

CraCRY是一种含有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子的蛋白质，其在蓝光照射下会经历光还原过程。这个过程涉及FAD的电子传递，同时伴随着蛋白的构象变化。研究发现，在蓝光照射下，CraCRY的FAD可以被还原为不同的状态，包括FADH^•（半醌态）和FADH^-（负离子态）。这些不同的FAD状态不仅影响蛋白的光化学反应，还可能影响其功能表现。例如，FADH^-态是光修复酶活动所必需的，而FADH^•态则可能与昼夜节律调控相关。

研究通过构建Y373位点的突变体（如Y373W、Y373R、Y373E）以及N395位点的突变体（如N395C）来进一步探讨这些残基在电子传递链中的作用。结果表明，Y373在电子传递过程中起到重要作用，尤其是在光还原过程中。Y373W突变体在蓝光照射下更容易进入FADH^-态，而Y373R和Y373E突变体则表现出较低的光还原效率。这表明Y373的电荷性质对其在光还原过程中的作用具有显著影响。

此外，研究还发现，当在还原环境中（如添加DTT、GSH或NADH）时，CraCRY的光还原效率显著提高，且其FAD更容易进入FADH^-态。这种还原环境不仅促进了FAD的还原，还抑制了光还原过程中的构象变化，从而影响了蛋白的功能表现。例如，在还原环境中，CraCRY的DNA修复活性增强，但其与ROC15的相互作用则被削弱。这说明蛋白的双重功能可能受到其所处微环境的影响。

### 构象变化与二聚化

蛋白的构象变化是其功能调控的重要环节。研究通过有限蛋白酶解和SDS-PAGE电泳分析了CraCRY在不同光还原条件下的构象变化。结果显示，在蓝光照射下，CraCRY更容易被蛋白酶解，且其构象变化的速率与光还原效率相关。Y373W突变体在蓝光照射下表现出更快的构象变化，而N395C突变体则因失去质子化能力，导致其构象变化速率减缓。这表明，N395和Y373这两个残基在光还原过程中对构象变化的调控具有关键作用。

同时，研究还发现，CraCRY在光诱导下会发生二聚化，这一现象在不同突变体中表现出差异。例如，Y373R和Y373E突变体在蓝光照射下表现出更高的二聚化率，而N395C突变体的二聚化率与野生型相近。此外，当在还原环境中（如添加DTT）时，CraCRY的二聚化被抑制，这说明还原环境可能通过影响电子传递链的活性来调控蛋白的聚集状态。

值得注意的是，一旦CraCRY形成二聚体，其对蓝光的响应能力显著降低。这意味着二聚化可能会影响蛋白的功能表现，尤其是在调控昼夜节律方面。这一发现提示我们，蛋白的构象变化和二聚化状态可能在不同的功能激活中起到不同的作用，而这些变化又与光还原过程中FAD的电子传递和质子化过程密切相关。

### 功能调控与微环境的影响

CraCRY的双重功能——DNA修复和昼夜节律调控——可能受到其所处微环境的影响。研究发现，在还原环境中，FAD更容易被还原为FADH^-态，从而促进DNA修复活性。然而，这种还原环境同时也抑制了蛋白的构象变化和与ROC15的相互作用，这可能意味着DNA修复和昼夜节律调控需要不同的FAD状态作为触发条件。

在实验中，研究者还发现，Y373的突变对蛋白的功能表现具有显著影响。例如，Y373W突变体在蓝光照射下表现出更强的光还原能力，而Y373R和Y373E突变体则表现出较低的光还原效率。这表明Y373的电荷状态和侧链结构对电子传递链的效率具有重要影响。此外，N395C突变体由于失去了质子化能力，其光还原效率较低，且难以进入FADH^-态，这进一步说明N395在光还原过程中的关键作用。

在DNA修复实验中，只有Y373W突变体表现出与野生型相似的修复能力，而Y373R和Y373E突变体则需要在还原环境中才能恢复部分修复功能。这提示我们，Y373可能在某些情况下作为电子供体，而在其他情况下则作为电子受体，从而影响FAD的氧化还原状态。这种动态调控机制可能是CraCRY能够同时执行两种功能的关键。

### 进一步的思考与研究意义

研究还探讨了CraCRY在光还原过程中，FAD的氧化还原状态是否直接导致构象变化。实验结果显示，N395C和Y373W-N395C突变体虽然无法进入FADH^-态，但其构象变化仍然发生，尽管速率较慢。这表明FAD的氧化还原状态可能不是构象变化的唯一驱动因素，而是与电子传递链的动态变化相互作用的结果。

此外，研究还发现，DTT等还原剂能够有效抑制CraCRY的二聚化，这可能与它们对电子供体的淬灭作用有关。这种现象提示我们，还原环境可能通过改变电子传递链的活性，从而影响蛋白的聚集状态和功能表现。

综上所述，CraCRY的双重功能可能与其在不同微环境下的电子传递链状态变化有关。Y373和N395这两个关键残基在光还原过程中起着至关重要的作用，它们不仅影响FAD的氧化还原状态，还可能通过改变电子传递链的动态行为，调控蛋白的构象变化和二聚化。这种调控机制为理解光敏蛋白的双重功能提供了新的视角，并为未来研究其他具有类似功能的蛋白奠定了基础。进一步的实验研究将有助于揭示这些关键残基的具体作用机制，以及它们如何在不同条件下实现功能的切换。