可扩展的纯化技术能够制备出高质量的类病毒颗粒，用于治疗应用

《Journal of Biological Chemistry》：Scalable purification enables high-quality virus-like particles for therapeutic translation

病毒样颗粒（VLPs）的纯化技术优化及其在基因编辑中的应用。研究提出了一种结合离子交换色谱和超速离心的纯化方法，显著提高VLP纯度（>90%特异性蛋白）和治疗效果，减少细胞来源蛋白污染。在mT/mG小鼠视网膜模型中，纯化后的ABE-eVLPs（腺嘌呤脱氨酶编辑）在低浓度（71 nM）下实现高效基因编辑（靶点编辑效率4.1%），优于传统RNP-LNP。该方法还成功应用于新型HIV-Gag基载的ENVLPEs+颗粒，在TIGER报告小鼠中实现15%视网膜色素上皮细胞（RPE）编辑。实验通过质谱分析（LC-MS/MS）和电泳验证纯化效果，并证实离子交换步骤（如DEAE树脂）对提高VLP回收率（达73%）和活性至关重要。研究为VLP类基因治疗药物开发提供了标准化、可扩展的纯化平台。

在现代生物医学研究中，基因编辑技术的快速发展为治疗多种遗传性疾病提供了新的可能。这些技术通常涉及将基因编辑工具，如CRISPR-Cas蛋白，直接递送至细胞内，以实现对特定基因位点的精准修改。然而，当前的递送方式面临着一系列挑战，特别是在临床转化过程中，如何确保递送载体的纯度和功能活性成为关键问题。病毒样颗粒（VLPs）因其高效的细胞进入能力，被认为是基因编辑领域的优选递送工具。然而，现有的VLP纯化方法，如超速离心法，往往存在产品纯度不一、难以大规模生产等问题。因此，开发一种更加高效、可扩展的VLP纯化策略显得尤为重要。

本研究提出了一种基于色谱技术的VLP纯化流程，能够显著提高VLP的纯度和治疗效果。该流程包括单步和多步色谱步骤，通过有效去除宿主细胞蛋白和细胞培养污染物，同时提高VLP的完整性与生物活性。在实验中，研究团队使用了多种基因编辑工具，包括CRISPR-Cas9、腺嘌呤脱氨酶（ABE）和原位编辑（PE）等，以评估该纯化方法的适用性。结果表明，经过色谱纯化的VLP在体内实验中展现出更高的治疗效果，且具有更优的蛋白组成和一致性。此外，质谱分析显示，纯化后的VLP中，特异性蛋白占比超过90%，有效降低了污染。

本研究的重点在于，如何通过色谱技术解决VLP纯化过程中的关键问题。传统的超速离心法虽然能够有效去除部分细胞培养液中的蛋白质，但无法完全清除宿主细胞蛋白，这可能导致体内治疗时产生不良反应。而通过结合使用Capto Core 700（CC700）和DEAE离子交换色谱，研究团队发现这些方法能够显著提高VLP的纯度，同时保留其生物活性。例如，在使用CC700和DEAE色谱的组合处理后，VLP的纯度得到了显著提升，且其在体内的活性也明显增强。此外，研究团队还发现，某些色谱步骤能够有效去除外源性蛋白质，如来自细胞培养液的血清蛋白，而保留VLP的活性成分。

通过进一步的实验，研究团队验证了该纯化方法在不同类型的VLP中的适用性。例如，对于使用HIV来源的VLPs，该方法同样能够显著提高其纯度和功能活性。这些VLPs在体内能够更有效地递送基因编辑工具，表现出比传统方法更高的效率。此外，研究还涉及对不同基因编辑工具在体内的效果评估，如使用ABE和PE工具修复rd12小鼠中的RPE65突变，结果显示，经过色谱纯化的VLP在恢复视力方面表现出色，且其在体内的编辑效率远高于未纯化的VLP。

本研究的意义在于，提供了一种可扩展、高效的VLP纯化策略，不仅能够提高VLP的纯度，还能增强其在体内的治疗效果。这种纯化方法通过分步色谱技术，能够在不影响VLP活性的前提下，有效去除杂质。此外，研究还指出，尽管色谱方法能够显著提高纯度，但最终的超速离心步骤仍然是不可或缺的，因为它能够进一步浓缩VLP，并确保其在体内的高效递送。

在实验方法方面，研究团队采用了一系列严谨的步骤，包括细胞培养、VLP的制备、纯化和功能验证。例如，在细胞培养过程中，使用了特定的培养基和细胞系，以确保VLP的高效生产。在纯化过程中，通过不同类型的色谱技术，如CC700和DEAE色谱，以及超速离心，逐步去除杂质。在功能验证方面，研究团队利用了多种实验方法，包括荧光显微镜、电子显微镜、质谱分析和电生理检测，以全面评估VLP的活性和纯度。

本研究还探讨了不同色谱条件对VLP纯度和活性的影响。例如，通过调整色谱柱的条件，如使用不同的缓冲液浓度和pH值，研究团队发现这些参数对VLP的纯化效果具有重要影响。此外，研究还发现，某些色谱步骤可能会导致特定蛋白的损失，如Cas9，这需要在实验设计中加以考虑。因此，为了优化纯化流程，研究团队建议结合多种色谱技术，并根据不同的VLP类型进行调整。

总的来说，本研究通过开发一种基于色谱技术的VLP纯化方法，为基因编辑技术的临床转化提供了新的思路。该方法不仅能够提高VLP的纯度和功能活性，还具有良好的可扩展性，适用于大规模生产。此外，研究还强调了在VLP纯化过程中，保持其生物活性的重要性，以及如何通过优化色谱条件来实现这一目标。这些发现对于未来基因编辑治疗的开发和应用具有重要的指导意义。