选择性肽引导的跨细胞转运能够增强外泌体介导的siRNA穿过血脑屏障的递送效果

《Journal of Biological Chemistry》：Selective Peptide-Guided Transcytosis Enhances Extracellular Vesicle-Mediated siRNA Delivery Across the Blood-Brain Barrier.

RVG修饰的小外泌体（sEVs）通过clathrin介导的内吞作用增强siRNA经血脑屏障（BBB）的转胞效率，显著提升神经元和星形胶质细胞靶向递送效果，其机制依赖于nAChR和p75NTR受体，而CPP.16因依赖非特异性吸附效率较低。

　　这项研究聚焦于利用外泌体（extracellular vesicles, EVs）作为载体，通过表面修饰特定的靶向肽，以实现对中枢神经系统（central nervous system, CNS）的非侵入性药物递送。随着神经退行性疾病、脑肿瘤和神经系统感染等疾病的发病率持续上升，开发能够安全、高效穿越血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）的治疗手段成为医学研究的重点。RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术作为一种新兴的基因治疗策略，已被广泛应用于多种疾病的治疗。然而，将小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）递送至大脑仍面临显著挑战，主要在于BBB的高度选择性和对分子的屏障作用。因此，研究如何优化EV作为siRNA递送载体，特别是如何提高其穿越BBB的能力，成为推动RNAi疗法在CNS疾病中应用的关键。

在众多靶向策略中，狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein, RVG）肽因其在EV表面修饰后能够显著提升全身递送效率而备受关注。RVG肽是一种由29个氨基酸组成的多肽，来源于狂犬病毒的糖蛋白，已被证实能够与神经元表面的烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）结合，从而促进EV进入大脑。尽管RVG肽在体外实验中表现出增强BBB穿透的能力，但其具体的分子机制仍存在争议，缺乏直接证据支持其作用原理。此外，细胞穿透肽（cell penetrating peptides, CPPs）也被广泛研究用于增强BBB跨膜运输效率，例如CPP.16，它已被用于改善腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）9型衣壳蛋白的脑递送能力。然而，CPP.16是否在EV系统中同样有效，尚不清楚，这引发了关于载体特异性限制的担忧。

本研究旨在揭示RVG和CPP.16修饰的EV在CNS药物递送中的作用机制，特别是其如何影响EV和siRNA的跨BBB运输效率。研究人员首先通过基因工程方法，将RVG或CPP.16肽与CD63蛋白的外显子区域融合，构建了能够稳定分泌EV的HEK293T细胞系。CD63是一种在EV表面高度表达的四跨膜蛋白，常被用作EV的标志物和支架蛋白。通过将增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）与CD63融合，研究人员能够更直观地观察EV的形态和分布。实验结果表明，经过RVG或CPP.16修饰的EV在形态、大小和生物生成过程中均未受到显著影响，从而确保了其作为药物载体的可行性。

在体外BBB模型中，研究人员发现，RVG修饰的EV（RVG-sEVs）相比未修饰EV（nc-sEVs）和CPP.16修饰的EV（CPP.16-sEVs）能够更有效地将siRNA递送至脑实质细胞。尽管三类EV在2小时内均能被内皮细胞摄取，但RVG-sEVs在6小时后显示出显著更高的siRNA积累，特别是在胶质瘤细胞（U87MG）中。这表明RVG修饰不仅促进了EV的跨BBB运输，还提高了其对脑细胞的靶向能力。进一步的实验表明，RVG-sEVs主要通过网格蛋白介导的内吞作用（clathrin-mediated endocytosis）进入内皮细胞，并通过早期和晚期溶酶体（EEA1和Rab7）进行高效内吞运输，最终释放至脑实质。相比之下，CPP.16-sEVs的内吞机制涉及更广泛的途径，包括网格蛋白和囊泡蛋白介导的内吞作用，但其在脑实质中的递送效率较低。

为了进一步验证RVG的作用机制，研究人员通过敲除或药理学抑制nAChR和p75NTR两种受体，评估它们在RVG-sEVs内吞过程中的参与程度。结果显示，nAChR的缺失对RVG-sEVs的内吞作用影响更为显著，表明nAChR在RVG介导的内吞过程中起主导作用。此外，研究人员还发现，RVG修饰的EV在体内实验中表现出更强的脑靶向能力，能够更有效地递送siRNA至神经元和星形胶质细胞，而CPP.16修饰的EV则主要滞留于血管周围，未能有效进入脑实质。这一发现强调了RVG在CNS药物递送中的独特优势，同时也揭示了CPP.16在EV系统中可能存在的局限性。

值得注意的是，尽管RVG修饰的EV在内皮细胞中表现出更强的荧光信号，但其内部的siRNA含量与未修饰EV并无显著差异。这一现象表明，RVG的作用可能在于促进siRNA从内吞途径中释放至脑实质，而不是单纯提高内皮细胞的siRNA摄取效率。换句话说，RVG可能通过减少siRNA在内吞体中的降解，提高其在细胞内的稳定性，从而增强其穿越BBB的能力。这一机制的发现为未来设计更高效的CNS靶向药物载体提供了新的思路。

本研究的结果对于推动RNAi疗法在神经疾病治疗中的应用具有重要意义。首先，RVG修饰的EV能够有效穿越BBB，并在脑实质中实现对多种细胞类型的靶向递送，这表明其具有作为通用药物载体的潜力。其次，研究揭示了RVG介导的跨BBB运输依赖于特定的受体-配体相互作用，特别是nAChR和p75NTR。这些发现不仅加深了我们对EV如何穿越BBB的理解，也为未来优化EV修饰策略提供了理论依据。此外，研究还指出，不同类型的修饰肽可能适用于不同的载体系统，强调了在设计靶向递送系统时需考虑载体的特异性。例如，虽然CPP.16在病毒载体中表现出良好的递送效果，但在EV系统中可能无法达到相同水平，这提示我们在应用这些肽时需进行载体特异性评估。

从实验设计的角度来看，研究人员采用了多种方法来验证其假设。例如，通过建立非接触式体外BBB模型，模拟了体内条件下的跨膜运输过程。该模型利用人类脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）和胶质瘤细胞（U87MG）的共培养体系，评估了EV在不同时间点的分布情况。此外，研究人员还使用了荧光成像技术，对体内递送效果进行了可视化分析。通过追踪Cy5标记的siRNA在脑组织中的分布，研究人员能够直观地观察到RVG-sEVs在脑实质中的富集情况，而CPP.16-sEVs则主要集中在血管周围，未能有效进入脑细胞。

本研究的另一个重要发现是，尽管RVG修饰的EV在内皮细胞中表现出更高的荧光信号，但其siRNA的总含量并未显著增加。这表明，RVG可能并不直接增加内皮细胞对siRNA的摄取，而是通过改变siRNA在细胞内的命运，使其更有可能通过跨细胞运输途径进入脑实质。这一机制的揭示为未来开发更高效的siRNA递送系统提供了关键信息。例如，如果能够设计出一种既能促进EV内吞，又能减少siRNA在内吞体中降解的修饰策略，那么将极大提高RNAi疗法在CNS疾病中的治疗效果。

此外，研究还涉及了EV的分离和表征技术。研究人员通过一系列离心步骤，从HEK293T细胞的培养上清中分离出EV，并利用纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）对其大小、形态和纯度进行了评估。这些技术的使用确保了实验中使用的EV具有高度的一致性和代表性，为后续的递送实验提供了可靠的基础。同时，Western blot分析进一步验证了EV表面标志物的表达情况，如CD63、TSG101和Alix，从而确认了EV的纯度和完整性。

从更广泛的意义来看，这项研究不仅揭示了RVG和CPP.16在EV递送中的作用差异，也为未来的药物递送系统设计提供了重要参考。例如，RVG可能更适合用于需要高靶向性和高效跨BBB运输的药物，而CPP.16可能更适合用于其他类型的载体，如病毒载体。此外，研究还强调了在药物开发过程中，需综合考虑靶向肽与载体的相互作用，以避免因载体特异性而影响递送效果。这为生物医学研究提供了新的方向，即在不同类型的药物载体上，需针对其特异性进行靶向肽的优化设计。

综上所述，本研究通过系统分析RVG和CPP.16修饰的EV在CNS药物递送中的作用机制，为RNAi疗法在神经疾病中的应用提供了重要的理论依据和技术支持。未来，随着对EV和靶向肽相互作用机制的进一步研究，有望开发出更高效、更安全的药物递送系统，从而推动基因治疗在临床中的应用。