Mast2激酶的特性决定了其结构特征、调控机制及底物识别能力

《Journal of Biological Chemistry》：Characterization of Mast2 Kinase Defines Structural Features, Regulation, and Substrates

本研究通过亲和选择质谱法高通量筛选，发现了一系列靶向心脏薄丝蛋白的小分子化合物，这些化合物能引起钙脱敏，并在 engineered heart tissue (EHT)模型中显示出改善收缩和舒张功能的潜力。通过化学优化和药代动力学评估，部分化合物在改善心肌收缩力方面显示出选择性，为治疗心力衰竭提供了新思路。

　　心脏疾病，尤其是心力衰竭（Heart Failure, HF）和肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM），是全球范围内导致显著死亡率和发病率的重要疾病。这些疾病的核心机制涉及心肌收缩功能的异常，包括收缩期（systolic）功能受损或舒张期（diastolic）功能障碍。心肌收缩依赖于复杂的钙离子调控系统，其中心肌细丝复合体（thin filament complex, TFC）在调节肌肉收缩和舒张过程中起着关键作用。本研究旨在通过高通量筛选方法，寻找能够特异性作用于TFC并实现钙离子敏感性降低的小分子药物，为心力衰竭和HCM提供新的治疗策略。

心肌收缩的基本单位是肌节（sarcomere），它由厚细丝（由肌球蛋白构成）和薄细丝（由肌动蛋白、肌钙蛋白和原肌球蛋白组成）构成。肌钙蛋白与钙离子的结合是调控肌动蛋白与肌球蛋白相互作用的关键步骤。当钙离子浓度升高时，肌钙蛋白复合体发生变化，使得肌球蛋白能够与肌动蛋白结合并进行ATP依赖的横桥循环，从而引发肌肉收缩。然而，任何对这一钙-肌动蛋白相互作用的干扰，无论是通过结构改变还是钙离子浓度的异常，都可能导致心肌收缩功能障碍。因此，针对TFC进行药物干预，可能成为治疗心力衰竭和HCM的新途径。

近年来，已有研究开发出多种靶向肌球蛋白的小分子药物，例如Mavacamten和Aficamten。Mavacamten通过抑制肌球蛋白ATP酶活性，被批准用于治疗阻塞性HCM。而Aficamten则通过另一种变构机制达到类似效果，并在2024年的III期临床试验中表现出积极的疗效。然而，这些药物通常具有多靶点作用，可能带来不必要的副作用。因此，开发一种具有高度特异性、仅针对TFC的钙敏感性调节药物，具有重要的临床意义。

本研究采用Affinity Selection Mass Spectrometry（ASMS）高通量筛选方法，从内部化合物库中筛选出能够与TFC结合的化合物。ASMS是一种无需依赖化合物功能信息的高通量生物物理筛选技术，可以在蛋白质-配体相互作用的背景下检测化合物的结合情况。通过这一方法，研究人员成功筛选出一个新型的化合物系列，该系列能够直接与TFC结合并影响其钙敏感性。这些化合物在重组生化系统和组织分离的肌节系统中均表现出显著的钙脱敏效果。

在进一步的优化过程中，研究人员对化合物的药代动力学特性（如内在清除率、细胞渗透性、溶解性等）进行了评估，并通过一系列功能测试验证了其在不同模型中的药效。例如，在小鼠肌节张力测定中，化合物表现出不同的拮抗剂和钙脱敏剂的药效特征。通过改变化合物的核心结构（如将硫原子替换为氧原子，或对R2和R4向量进行优化），研究人员获得了具有更高药效和更好药代动力学特性的化合物，如化合物3和5。这些化合物在保持高钙敏感性降低的同时，也表现出对最大张力的一定抑制作用，从而形成一种混合药效特征。

在对TFC的结合特性进行研究时，研究人员利用等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）进一步验证了化合物与TFC的相互作用。结果显示，化合物4在完整TFC中表现出显著的结合，而在单独的肌动蛋白-原肌球蛋白或肌钙蛋白复合体中则没有明显结合。这表明化合物可能作用于TFC内部的蛋白质-蛋白质相互作用界面或仅在完整复合体结构中形成的结合口袋。这一发现为理解化合物的结合机制提供了重要线索。

在进一步的实验中，研究人员使用工程化心脏组织（Engineered Heart Tissue, EHT）模型评估了化合物的药效。EHT是由人类诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心肌细胞和人源心脏成纤维细胞在去细胞猪心肌基质中培养而成的多细胞模型。这种模型能够模拟心肌的复杂结构和功能，因此是评估药物在疾病状态下的作用机制的理想工具。研究人员发现，化合物3和5在高剂量下显著降低了心肌的最大张力，并加快了力的放松过程，这与在小鼠肌节张力测定中观察到的混合药效特征一致。此外，这些化合物对EHT中钙敏感性的改变与在体外实验中观察到的结果高度吻合，表明其在心脏组织中的药效具有一定的可预测性和一致性。

尽管本研究未发现具有“纯”钙脱敏剂特性的化合物，但通过高通量筛选和药效评估，研究人员成功识别出具有混合药效特征的化合物系列。这些化合物在保持钙敏感性降低的同时，也对最大张力产生了一定的抑制作用，这可能意味着它们在治疗心力衰竭和HCM时，能够同时改善收缩和舒张功能。然而，由于筛选过程的低通量性质，研究人员仅对少数化合物进行了详细分析，因此仍需进一步扩大化合物库并进行更全面的药效评估。

本研究的成果表明，通过高通量筛选技术，可以高效地识别出能够靶向TFC并调节其钙敏感性的小分子药物。这些化合物在不同实验模型中均表现出良好的药效和选择性，为开发新的治疗策略提供了重要的基础。尽管目前尚未找到具有完全脱敏作用的化合物，但混合药效特征的化合物在治疗心力衰竭和HCM方面可能具有更大的潜力。未来的研究可以进一步优化这些化合物的结构，以提高其钙脱敏特异性，并减少对其他靶点的非特异性作用。此外，利用更先进的生物物理技术，如氢-氘交换（Hydrogen-Deuterium Exchange, HDX）或化学蛋白质组学（chemoproteomics），有助于更深入地解析这些化合物的结合位点和作用机制。

总之，本研究为靶向TFC的小分子药物开发提供了重要的实验依据和方法论支持。通过高通量筛选、药效优化和药理学评估，研究人员成功识别出一系列具有钙脱敏和拮抗作用的化合物，这些化合物在治疗心力衰竭和HCM方面展现出良好的潜力。尽管仍需进一步研究以确定其最佳作用模式和安全性，但这一发现为未来开发针对心肌收缩功能障碍的新药奠定了坚实的基础。