基于FRET双杂交检测的活细胞中靶点药物筛选

《Journal of Bone Oncology》：FRET two-hybrid assay-based target drug screening in living cells

本研究开发了基于活细胞FRET的两杂交筛选方法（FRET-HBTDS），通过分析Bcl-xL与Bak的相互作用评估8种化合物对凋亡蛋白复合物的影响。结果显示A1331852和DSF/Cu显著改变FRET效率和复合物比例，表明FRET-HBTDS能有效筛选靶向蛋白相互作用药物。

精准的靶向药物筛选是提高肿瘤靶向治疗效率的关键。本研究提出了一种基于活细胞荧光共振能量转移（FRET）双杂交实验的靶向药物筛选方法，即FRET-HBTDS。该方法通过在96孔板中培养同时表达供体和受体标记靶蛋白的细胞，利用自建的自动化FRET显微镜（FRETscope）对每个孔进行定量FRET成像，再通过FRET双杂交实验获取最大供体中心FRET效率（E_Dmax）、最大受体中心FRET效率（E_Amax）以及受体与供体的摩尔比（N_A/N_D）。实验中对八种化合物（A1331852、S63845、AC、DSF/Cu、Met、REGO、SOFA、ABT199）进行了评估，这些化合物对Bcl-xL和Bak之间的相互作用产生了不同影响。在7小时的处理后，仅A1331852组显示出与对照组相比显著降低的E_Dmax和E_Amax，同时N_A/N_D显著增加，这表明A1331852能够解锁Bcl-xL与Bak之间的直接相互作用，从而释放Bak并诱导细胞死亡。此外，DSF/Cu组的N_A/N_D显著高于对照组，说明DSF/Cu改变了Bcl-xL-Bak复合物的组成比例。研究结果表明，FRET-HBTDS能够有效评估药物对靶蛋白及其下游蛋白相互作用状态的影响，揭示目标蛋白的结合状态和复合物的分子结构，这为靶向药物筛选提供了一种新的可能性。

药物筛选方法的优化对于降低新药开发的时间和成本至关重要。新药开发通常是一个漫长且昂贵的过程，平均耗时12年，费用高达66亿美元，成功率仅为0.01%至0.02%。这一过程通常从疾病机制的理解、靶点识别和验证开始，随后进行计算筛选和实验验证，以寻找具有特定生理活性的化合物。目前，药物筛选主要采用两种策略：基于靶点的筛选和基于表型的筛选。基于靶点的筛选依赖于高通量、带有标记的分子实验，以测量化合物对特定靶点蛋白在体外的影响。而基于表型的筛选则采用无偏的实验方法，评估化合物对细胞、组织或动物的整体效应。

自基因组学时代以来，基于靶点的药物发现（TDD）已成为主流范式。这一方法关注与疾病发生机制相关的蛋白，例如遗传性或机制性靶点。遗传性靶点涉及与疾病突变或风险相关的基因或其产物，如阿尔茨海默病和精神分裂症。而机制性靶点则包括在健康个体中并不具有显著差异的受体、酶或其他生物分子。高通量筛选（HTS）是基于靶点药物发现的核心技术之一，能够快速识别针对特定分子靶点的化学探针或“命中”化合物。例如，通过HTS发现的药物包括用于代谢性疾病的西他列汀（Sitagliptin）和用于心血管疾病的博舒替尼（Bosentan）。此外，HTS也被用于筛选针对膀胱癌的化合物，如斯特维奥斯苷（Steviosid），以及针对宫颈癌的靶向药物筛选平台。

FRET技术因其高灵敏度和广泛应用，成为研究分子相互作用的重要工具。它已被成功应用于高通量筛选，例如Chow等人建立的高通量FRET技术用于筛选针对SARS-CoV 3CL蛋白酶的化合物。Tian等人则利用基于半胱天冬酶FRET探针的高通量筛选方法，成功筛选出具有抗宫颈癌活性的传统中药化合物。Lo等人使用FRET为基础的高通量筛选方法，筛选出能够抑制亨廷顿蛋白（Httex 1）聚集的小分子抑制剂。Osterlund等人利用荧光寿命成像（FLIM）结合FRET技术，评估Bcl-2家族蛋白相互作用抑制剂的效力和特异性。Klostermeier等人利用FRET技术监测RNA构象变化和S15蛋白结合，并通过高通量筛选初步筛选出潜在的抑制核糖体组装的小分子化合物。

本研究旨在开发一种基于活细胞FRET双杂交实验的靶向药物筛选方法，即FRET-HBTDS。该方法通过FRET双杂交实验分析药物对靶蛋白及其下游蛋白状态的影响。我们特别关注Bcl-xL和Bak这两种关键的凋亡调控蛋白，以展示FRET-HBTDS在评估药物对蛋白复合物动态变化方面的作用。实验中，使用FRETscope（一种配备20倍物镜的宽场显微镜）对MCF-7、Huh7和H1299等活细胞中的Bcl-xL和Bak相互作用进行检测。通过该方法，我们不仅能够实时分析药物对细胞内蛋白相互作用的影响，还能够为发现能够调控关键蛋白-蛋白相互作用（PPIs）的新治疗药物提供一个平台。

FRET-HBTDS方法的开发为药物筛选提供了更深入的视角。传统药物筛选方法通常关注药物对单一靶点的直接作用，而FRET-HBTDS则能够揭示药物对蛋白复合物整体结构和动态变化的影响。这种方法不仅能够评估药物对靶蛋白结合状态的改变，还能够检测药物对复合物组成比例的调节作用。这种多维分析能力使得FRET-HBTDS在药物筛选中具有独特的优势。例如，通过观察E_Dmax和E_Amax的变化，可以判断药物是否干扰了Bcl-xL和Bak之间的相互作用；而通过分析N_A/N_D的变化，则可以进一步了解药物是否改变了复合物的结构或组成。

本研究的实验设计和条件优化是FRET-HBTDS方法成功应用的基础。首先，我们在FRETscope上对96孔板中的细胞进行FRET双杂交实验，以分析化合物对Bcl-xL与Bak结合的影响。具体而言，MCF-7、Huh7和H1299细胞被接种在96孔板中，并在含有5% CO?的湿润培养箱中培养过夜。随后，这些细胞被转染不同浓度的CFP标记和YFP标记的蛋白质粒。在药物处理7小时后，通过FRETscope对每个孔进行定量成像，获取E_Dmax、E_Amax和N_A/N_D等关键参数。这些参数的变化反映了药物对蛋白相互作用状态的影响。

FRET-HBTDS方法的优化不仅体现在实验条件的设置上，还体现在数据分析和处理的流程中。通过使用自建的自动化FRET显微镜，我们能够在短时间内对大量细胞样本进行高通量分析，从而提高筛选效率。同时，定量FRET成像技术的应用使得我们能够准确测量FRET信号的变化，为药物作用机制的解析提供可靠的数据支持。此外，实验过程中对药物处理时间和浓度的精确控制，确保了实验结果的可重复性和准确性。

本研究的讨论部分进一步探讨了FRET-HBTDS方法在药物筛选中的应用潜力。通过FRET双杂交实验，我们能够实时监测药物对细胞内蛋白相互作用的影响，这在传统的离体实验中难以实现。FRET技术能够提供分子层面的信息，帮助研究人员理解药物如何作用于特定的蛋白复合物，以及这种作用是否导致了细胞功能的变化。例如，在本研究中，A1331852的处理导致Bcl-xL与Bak之间的FRET效率显著下降，同时N_A/N_D增加，这表明该药物可能通过解除Bcl-xL与Bak的结合，促使Bak发挥其促凋亡功能，从而诱导细胞死亡。

DSF/Cu的处理则显示出不同的效应，即N_A/N_D显著增加，但E_Dmax和E_Amax并未明显下降。这可能意味着DSF/Cu改变了Bcl-xL-Bak复合物的结构，而不是直接破坏其结合状态。这种结构改变可能影响了复合物的功能，进而影响细胞的凋亡过程。因此，FRET-HBTDS方法不仅能够检测药物对蛋白结合状态的影响，还能够揭示药物对复合物结构的潜在调控作用。

本研究的实验结果表明，FRET-HBTDS方法能够有效评估药物对靶蛋白及其下游蛋白相互作用的影响。该方法通过结合FRET技术和高通量筛选平台，实现了对活细胞中蛋白复合物动态变化的实时监测。这种能力使得研究人员能够在更接近生理条件的环境中评估药物的生物效应，从而提高筛选的准确性和可靠性。此外，FRET-HBTDS方法还具有较高的灵活性，可以应用于多种不同的蛋白相互作用系统，为药物筛选提供了更广泛的应用前景。

在药物筛选领域，FRET-HBTDS方法的引入代表了一种新的研究方向。传统方法往往依赖于离体实验，无法全面反映药物在活细胞中的真实作用。而FRET-HBTDS方法能够在活细胞中实时检测药物对蛋白相互作用的影响，从而更准确地预测其潜在的治疗效果。这种方法的开发不仅提高了药物筛选的效率，还为研究药物作用机制提供了新的工具。通过观察E_Dmax、E_Amax和N_A/N_D的变化，研究人员可以更深入地了解药物如何影响蛋白复合物的结构和功能，从而为药物设计和优化提供依据。

FRET-HBTDS方法的另一大优势在于其对药物作用的多维度分析能力。传统的药物筛选方法通常只关注单一的生物指标，而FRET-HBTDS则能够同时监测多个参数，如FRET效率和蛋白比例，从而提供更全面的药物作用信息。这种多参数分析有助于识别那些具有复杂作用机制的药物，这些药物可能通过多种途径影响蛋白相互作用，进而发挥其治疗效果。例如，某些药物可能通过改变蛋白的构象或与其他蛋白形成复合物来影响靶蛋白的活性，而这些变化在传统的离体实验中可能难以检测。

此外，FRET-HBTDS方法还具有较高的可扩展性。由于该方法基于FRET技术和高通量成像，因此可以轻松应用于大规模的药物筛选项目。这使得研究人员能够在较短时间内评估大量化合物对特定蛋白相互作用的影响，从而加速药物发现的进程。同时，该方法还可以与其他高通量筛选技术相结合，例如基因表达分析、蛋白质组学和代谢组学，以提供更全面的药物作用信息。

在实际应用中，FRET-HBTDS方法可以用于多种疾病的药物筛选，包括癌症、神经退行性疾病和心血管疾病等。对于癌症治疗而言，许多药物的作用机制与特定的蛋白相互作用有关，因此FRET-HBTDS方法能够提供重要的实验依据。例如，Bcl-xL和Bak之间的相互作用在细胞凋亡调控中起着关键作用，因此评估药物对这一相互作用的影响对于开发新的抗癌药物具有重要意义。同样，在神经退行性疾病的研究中，某些药物可能通过影响特定的蛋白相互作用来发挥治疗作用，FRET-HBTDS方法能够帮助研究人员更准确地评估这些药物的效果。

本研究的实验结果还表明，FRET-HBTDS方法能够揭示药物对蛋白复合物结构的潜在影响。这种结构变化可能与药物的治疗效果密切相关。例如，某些药物可能通过改变蛋白的构象来影响其与其他蛋白的相互作用，从而调节细胞内的信号传导通路。通过FRET-HBTDS方法，研究人员可以检测到这些结构变化，并进一步分析其对细胞功能的影响。这种能力使得FRET-HBTDS方法在药物筛选中具有独特的价值，能够帮助研究人员更全面地理解药物的作用机制。

综上所述，FRET-HBTDS方法是一种具有广阔应用前景的靶向药物筛选技术。该方法结合了FRET技术的高灵敏度和高通量筛选平台的高效性，能够在活细胞中实时监测药物对蛋白相互作用的影响。通过分析E_Dmax、E_Amax和N_A/N_D等参数的变化，研究人员可以更准确地评估药物的生物效应，并揭示其作用机制。本研究的实验结果表明，FRET-HBTDS方法能够有效评估药物对Bcl-xL-Bak相互作用的影响，为靶向药物筛选提供了新的工具和思路。未来，随着FRET技术的不断进步和高通量成像平台的进一步优化，FRET-HBTDS方法有望在药物筛选领域发挥更大的作用，为新药的开发和优化提供更有力的支持。