验证一种符合国际协调协议要求的测量程序，用于通过排除血小板成分的红细胞门控策略进行网织红细胞计数

《Cytometry Part B: Clinical Cytometry》：Validation of a candidate international harmonisation protocol-compliant measurement procedure for reticulocyte counting using an erythrocyte gating strategy excluding the platelet component

国际协调协议（IHP）推荐流式细胞术（FCM）作为小红细胞检测的标准方法。本研究通过比较新开发的TO/CD41a/CD61-MP与现有TO/CD235a-MP方法，验证其符合IHP要求。实验采用NMB-IHP作为高阶参考方法，结果显示TO/CD41a/CD61-MP与TO/CD235a-MP高度一致（r=0.998），且在XN-2000和Celltac G+分析仪上的准确性良好（r=0.97）。该方法通过CD45/CD41a/CD61抗体排除血小板干扰，解决了传统方法中红细胞与血小板重叠的问题。

　　本研究聚焦于一种新型的流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）测量程序（Measurement Procedure, MP），旨在验证其是否符合国际统一协议（International Harmonisation Protocol, IHP）的要求，用于检测网织红细胞（Reticulocyte）的百分比（%Retic）。网织红细胞是红细胞未完全成熟的阶段，其存在通常与血液系统疾病相关，如贫血、溶血性贫血等。传统的网织红细胞计数方法依赖于显微镜下的染色观察，即使用新甲基蓝（New Methylene Blue, NMB）进行超活染色（NMB-IHP），但该方法存在操作繁琐、计数误差大以及对操作者依赖性强等局限性，难以满足现代临床对高精度和可重复性的需求。因此，开发符合IHP标准的FCM MP成为一项重要任务，以提高网织红细胞计数的准确性并减少人为误差。

在本研究中，研究人员提出了三种基于FCM的测量方法，分别是TO-MP（使用硫唑橙（Thiazole Orange, TO）进行核酸染色，未使用免疫染色）、TO/CD235a-MP（使用TO进行核酸染色，结合CD235a抗体进行红细胞分选）以及TO/CD41a/CD61-MP（使用TO进行核酸染色，结合CD41a、CD61和CD45抗体进行红细胞分选）。其中，TO/CD235a-MP因其对红细胞与血小板的分离能力较强，目前被广泛应用于临床。然而，该方法在实际操作中仍存在一定的问题，如血小板与成熟红细胞的信号重叠可能造成假阳性结果，以及使用CD235a抗体可能导致成熟红细胞与血小板的聚集，影响测量的准确性。因此，研究人员开发了TO/CD41a/CD61-MP，试图通过改进红细胞分选策略，减少假阳性事件并避免样本聚集，从而提升测量的可靠性和精确性。

为了验证TO/CD41a/CD61-MP是否符合IHP标准，研究团队首先将其与NMB-IHP进行了比较。NMB-IHP是当前国际公认的最高层级校准方法，其通过严格的染色时间、温度和操作人员培训，确保测量结果的稳定性。然而，由于NMB-IHP仅能对少量细胞进行计数，其变异系数（Coefficient of Variation, CV）较高，难以提供足够的测量不确定性信息。相比之下，FCM可以同时对大量细胞进行检测，从而获得更精确的测量结果和更小的CV。通过回归分析，研究团队发现TO/CD41a/CD61-MP与TO/CD235a-MP之间具有良好的一致性，且其测量值的变异范围更小，表明其在减少误差和提高准确性方面具有显著优势。此外，TO/CD41a/CD61-MP在正常范围内的重复测量变异也低于TO/CD235a-MP，进一步验证了其在实际应用中的稳定性。

研究团队还评估了TO/CD41a/CD61-MP在不同自动化血液分析仪上的实际应用效果，包括Sysmex XN-2000?和Nihon Kohden Celltac G?+??。结果表明，TO/CD41a/CD61-MP与两种分析仪之间的相关系数均达到0.97，说明其在广泛的%Retic范围内具有高度的可重复性和一致性。在低浓度和高浓度的网织红细胞样本中，TO/CD41a/CD61-MP的测量结果与分析仪之间呈现出一定的偏差趋势，但在可接受范围内，表明该方法在不同浓度水平下仍能保持较高的准确性。这一结果不仅证明了TO/CD41a/CD61-MP作为IHP符合测量程序的有效性，还表明其在临床检测中具有广泛的适用性。

进一步分析显示，TO/CD41a/CD61-MP通过排除未染色的血细胞成分（如血小板），显著减少了假阳性事件的发生。同时，该方法在使用抗体时采用了更为合理的分选策略，避免了血小板和成熟红细胞的聚集问题。这在一定程度上提高了测量的准确性和可重复性，使其成为一种更可靠的替代方案。此外，TO/CD41a/CD61-MP还通过设定TO荧光信号的最小检测分辨率，确保了在阴性对照中能够准确识别和计数网织红细胞，从而减少了分选过程中的误差。

尽管TO/CD41a/CD61-MP在多个方面表现出色，但研究也指出了一些潜在的改进方向。例如，目前使用的TO染色剂在流式细胞术中可能存在荧光强度不一致的问题，这可能影响测量的灵敏度和特异性。因此，未来可以考虑使用其他核酸染色剂，如Syto13或吖啶橙（Acridine Orange），这些染色剂具有更高的荧光强度和对RNA的更高选择性，有助于更精确地识别网织红细胞的RNA残留。此外，随着技术的发展，进一步优化抗体组合和分选策略，可以进一步提高FCM在网织红细胞检测中的准确性和稳定性。

本研究不仅为FCM在网织红细胞检测中的应用提供了新的方法，也为国际标准的制定提供了重要的实证支持。通过验证TO/CD41a/CD61-MP的准确性，研究人员证明了该方法可以作为IHP符合测量程序，从而为临床提供更可靠、更高效的检测手段。未来，随着更多基于FCM的测量方法的开发和验证，网织红细胞的检测将更加标准化，有助于提高诊断的准确性和一致性。同时，这一研究也为临床实验室提供了实际操作的参考，帮助他们在选择合适的检测方法时，兼顾准确性、可重复性和实际可行性。