基于咪唑鎓型离子液体的色谱介质对RNA和蛋白质的吸附与分离：反离子的影响

《Journal of Chromatography A》：Adsorption and separation of RNA and protein on imidazolium-type ionic liquids-based chromatographic media: influence of counterions

离子液体对离子调控的色谱介质在生物大分子分离中的应用研究，制备了四种不同对离子（Cl?、H?PO??、BZA?、HBS?）修饰的GigaMIm介质，发现苯环对离子介质虽降低吸附容量但提升混合物分离分辨率，分子对接显示氢键和π-π堆积起关键作用，并成功应用于eGFP mRNA纯化。

　　这项研究探讨了基于咪唑??离子液体（ILs）的色谱介质中反离子类型对生物大分子吸附和分离的影响。研究团队设计了一种新型的GigaMIm色谱介质，通过将可离子化的1-甲基咪唑（MIm）与具有巨大孔隙的微球（Giga P）进行化学偶联，从而制备出具备多模式结合能力的色谱支持材料。该材料被分别与四种不同的反离子配对，包括无机反离子氯离子（Cl?）和二氢磷酸根离子（H?PO??），以及两种含有芳香环的有机反离子——苯甲酸根离子（BZA?）和4-羟基苯磺酸根离子（HBS?）。研究发现，反离子的类型对酵母RNA和牛血清白蛋白（BSA）的吸附动力学和等温线产生了显著影响，并进一步影响了RNA-BSA混合物的色谱分离效果。

与使用无机反离子的GigaMIm介质相比，含有芳香环的反离子配对的GigaMIm介质表现出稍慢的孔扩散动力学和较低的RNA和BSA吸附容量，但在混合物分离方面提供了更好的分辨率。分子对接分析表明，咪唑??阳离子与反离子（如HBS?或BZA?）之间增强的氢键作用有助于提高分离效果。此外，研究团队还通过从体外转录系统中分离增强型绿色荧光蛋白（eGFP）mRNA的实验验证了这一反离子调节策略。实验结果显示，与使用Cl?的GigaMIm相比，使用HBS?的GigaMIm在mRNA回收率（38.42% vs. 30.94%）方面更高，同时保持了较高的mRNA纯度和较低的T7聚合酶残留（0.16% vs. 0.21%）。这些结果表明，通过调节离子液体中的反离子，可能为优化核酸和蛋白质分离提供一种有前景的策略。

研究背景指出，随着对高纯度核酸需求的增加，需要从复杂的生物混合物中高效分离核酸，尤其是对于像体外转录系统这样的挑战性原料。体外转录系统包含多种蛋白质、核酸种类及其结构类似物，因此分离难度较大。核酸的主链上富含负电荷的磷酸基团，使得阴离子交换色谱成为一种有吸引力的分离方法。同时，核酸碱基也能通过氢键、π?π堆积和疏水相互作用与固定相相互作用，因此一些多模式配体被设计用于利用这些相互作用。其中，基于咪唑??的离子液体因其在生物大分子分离中的潜力而受到关注，通常通过将阳离子功能基团与固相进行化学偶联来作为配体。例如，Sousa团队通过将聚合物或无机硅微球与咪唑??离子液体或其衍生物进行功能化，制备了一系列色谱支持材料。研究表明，可离子化的咪唑??阳离子不仅能提供阴离子交换相互作用的正电荷中心，还能与核酸形成氢键和疏水相互作用，从而实现选择性分离。

对于所谓的离子液体配体，尽管在固定化过程中结构会发生变化，但离子液体的固有物理化学性质仍可保留，这些性质主要由其阳离子核心和反离子的结构决定。因此，离子液体的性质受到多种作用力的共同影响。除了阳离子与反离子之间的主导库仑吸引力外，一些局部和定向的相互作用，如氢键和色散力，也在决定离子液体整体结构和性质方面发挥着关键作用。迄今为止，改善基于咪唑??离子液体的色谱介质选择性的研究主要集中在对咪唑??离子液体配体侧链的合成修饰上。Carapito团队的研究表明，改变咪唑??离子液体配体侧链上的功能基团可以显著影响RNA的吸附和洗脱特性。然而，与对固定化阳离子的合成修饰相比，另一种可能更简单的策略是通过改变与离子液体配对的反离子来调节选择性。已有研究表明，在气相色谱中，反离子的种类可以通过其整体偶极性和氢键碱性影响溶质的保留特性。然而，这一原理是否适用于大生物分子的液相色谱，以及反离子如何调节核酸与离子液体配体的结合行为，仍然是一个尚未充分探索的问题。

除了核酸之外，蛋白质也会与离子液体表现出多种类型的相互作用，包括静电相互作用、疏水相互作用和氢键作用。由于核酸通常来源于生物材料如细胞和组织，或者通过体外转录（IVT）合成，这两种方法都会不可避免地引入各种杂质。特别是，IVT还会引入T7 RNA聚合酶和模板DNA。因此，深入了解离子液体作为配体时，反离子对核酸和蛋白质吸附行为和分离选择性的影响，对于指导设计用于混合体系中核酸分离和纯化的配体具有重要意义。

为此，研究团队将可离子化的1-甲基咪唑（MIm）与基于聚甲基丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯的巨孔微球（Giga P）进行化学偶联，制备出GigaMIm色谱介质。研究中使用了两种无机反离子——氯离子（Cl?）和二氢磷酸根离子（H?PO??），以及两种含有芳香环的有机反离子——苯甲酸根离子（BZA?）和4-羟基苯磺酸根离子（HBS?）。有机反离子中芳香环的存在可能引入额外的相互作用机制，如疏水相互作用、氢键和π?π堆积，从而提供替代的结合模式。研究团队对这四种不同反离子对酵母RNA和BSA的吸附行为和分离效果进行了全面研究。结合分子对接分析，探讨了反离子如何影响生物大分子与离子液体配体的多模式相互作用的可能机制。此外，还对从体外转录系统中分离eGFP mRNA的影响进行了进一步评估。

实验部分详细描述了化学试剂和材料的来源与特性。Giga P是由聚缩水甘油基甲基丙烯酸酯骨架和环氧基团组成的巨孔微球，由Senhui Microsphere Technology（苏州，中国）提供，并按照Zhou团队的方法制备。这些微球的粒径为41.45 μm，平均孔径为142.20 nm，孔隙率为约20.34%。1-甲基咪唑（MIm，纯度≥99%）、苯甲酸钠（NaBZA）和4-羟基苯磺酸钠等化学试剂也用于实验。

关于GigaMIm的合成与表征，研究团队通过（3-氯丙基）三甲氧基硅烷活化Giga P的环氧基团，随后偶联1-甲基咪唑配体，从而制备出GigaMIm色谱介质。扫描电子显微镜（SEM）观察显示，GigaMIm介质具有球形结构，粒径约为40 μm，与修改前的Giga P一致。这表明，巨孔微球在偶联过程中保持了良好的形态和孔结构，没有受到破坏。通过这些表征手段，研究人员确认了GigaMIm介质的结构特性及其在分离过程中的适用性。

结论部分总结了本研究的主要发现。研究发现，反离子的类型对酵母RNA和BSA的吸附行为和分离效果产生了显著影响。两种生物大分子在GigaMIm介质上吸附时，主要通过形成静电相互作用和氢键作用。与使用无机反离子的GigaMIm相比，使用含有芳香环的反离子的GigaMIm介质在混合物分离方面表现出更高的分辨率。这一结果进一步验证了反离子调节策略在优化核酸和蛋白质分离中的潜力。通过实验，研究团队证明了使用HBS?的GigaMIm在mRNA回收率方面优于使用Cl?的GigaMIm，同时保持了较高的mRNA纯度和较低的T7聚合酶残留。这些发现不仅为改进离子液体基色谱介质提供了新的思路，也为从复杂混合体系中高效分离和纯化核酸和蛋白质提供了理论依据。

此外，研究团队还强调了本研究的贡献。Ziang Yan负责方法设计、实验实施、原始论文撰写；Jingyang Zhao参与方法设计和论文撰写与修改；Xuan Lin参与实验实施；Zhengjun Li负责实验验证；Weiqing Zhou和Xiangming Na参与方法设计；Zhiguo Su负责监督；Songping Zhang则负责概念设计、方法设计、监督、资源调配和论文撰写与修改。这些分工确保了研究工作的系统性和完整性，同时也体现了团队成员在不同研究环节中的贡献。

最后，研究团队声明不存在与本研究相关的竞争性利益关系，以确保研究结果的客观性和公正性。同时，研究得到了中国科学院战略性优先研究计划（项目编号XDB1250000）、国家自然科学基金（项目编号22478401）以及国家生物制药制备与输送重点实验室自主部署项目（2024-FX-A-03）的资助。这些支持为研究的顺利进行提供了必要的资源和条件，确保了研究的深度和广度。

综上所述，这项研究通过系统地分析反离子类型对离子液体基色谱介质吸附和分离性能的影响，揭示了反离子在调控生物大分子结合行为中的关键作用。研究不仅提供了理论依据，也为实际应用中的色谱分离优化提供了可行方案。通过实验验证，研究团队证明了含有芳香环的反离子在提高分离分辨率方面的优势，同时保持了较高的回收率和纯度。这些发现对推动生物制药领域中核酸和蛋白质的高效分离具有重要意义，也为未来相关研究提供了新的方向。