综述：利用UPLC-QTRAP/MS技术同时检测牛毛中的八种四环素：一种新型的无创兽医药物残留检测方法

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Simultaneous determination of eight tetracyclines in cattle hair using UPLC-QTRAP/MS: A novel non-invasive strategy for veterinary drug residue

牛毛基质高效液相色谱-串联质谱法检测八种四环素类抗生素残留并验证其在新疆北疆地区应用，建立灵敏度高（LOD 0.3 ng/kg）、线性相关系数＞0.999的分析方法，成功检测到极低残留水平（＜100 ng/kg），为非法药物使用追踪和环境健康风险评估提供新工具。

　　本研究聚焦于在畜牧业中滥用四环素类抗生素（TCS）所导致的环境残留问题，以及这些问题对生态和人类健康的潜在威胁。随着集约化和大规模畜牧业的发展，药物和饲料添加剂的广泛使用使动物产品中残留药物的问题日益严重。四环素类抗生素因其广谱抗菌特性、低成本以及促进动物生长的作用，在畜牧业中被广泛使用。例如，庆大霉素和土霉素常用于预防和治疗牲畜和家禽的传染病，同时作为生长促进剂添加到饲料中。然而，由于这些抗生素无法被动物完全吸收，大部分以原形或代谢产物的形式通过粪便和尿液排出，从而在环境中积累，形成较高的残留水平。

在中国北方土壤环境中，四环素类抗生素的残留量可达0.021-0.105 mg/kg，而在广州某农场的土壤中，平均残留量高达175.77 mg/kg。这种高残留不仅对生态环境构成威胁，还可能通过食物链进入人体，沉积在骨骼和牙齿中，导致牙齿变黄等问题。此外，四环素类药物可能在肝脏中积累，造成肝损伤。长期食用含有四环素残留的动物食品，对人类健康存在潜在危害。

为了应对这一问题，传统生物基质（如血液、尿液）的检测方法存在明显的局限性。这些方法具有较强的侵入性，且代谢周期较短，导致检测窗口有限，难以追踪长期或历史性药物暴露。此外，传统基质中的药物残留检测灵敏度较低，通常在微克/千克（μg/kg）或皮克/千克（ppb）范围内，无法满足对环境累积或低剂量长期暴露的追踪需求。相比之下，本研究采用牛毛作为非侵入性检测基质，开发了一种基于超高效液相色谱-三重四极杆/线性离子阱质谱（UPLC-Qtrap/MS）的高灵敏度检测方法，能够同时检测八种四环素类抗生素。

该方法的验证结果显示，线性相关系数大于0.999，回收率在82.79%-98.55%之间，变异系数小于15%，检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.3 ng/kg和1.0 ng/kg，显著优于现有方法。该方法在新疆北部地区进行了初步应用，对50份牛毛样本进行了检测，结果表明该方法具有实际应用价值。此外，研究还简要探讨了四环素类药物在牛毛中的微结构、化学组成及可能的代谢途径。研究结果表明，牛毛能够稳定地富集药物残留，为追踪畜牧业中的非法药物使用提供了创新解决方案，并为制定新的药物监管标准和进行环境健康风险评估提供了技术支持。

四环素类抗生素的检测通常依赖于生物基质，如血液、尿液和肌肉组织，但这些方法在实际应用中存在诸多问题。例如，四环素类药物在血液和尿液中的代谢半衰期较短，通常在几小时到几天之间，导致检测窗口较窄，可能错过长期或历史性的药物暴露。此外，这些传统基质中的药物残留检测灵敏度有限，难以满足对超低浓度残留的检测需求。相比之下，牛毛作为一种非侵入性基质，具有许多优势。例如，牛毛易于获取，不会对动物造成创伤或痛苦，且药物在牛毛中的保留时间较长，可达数周或数月，甚至更久。此外，牛毛对环境因素的干扰较为敏感，因此药物残留在牛毛中的稳定性较高，有助于追溯药物使用的历史。

本研究开发的检测方法在多个方面优于现有技术。首先，该方法使用UPLC-Qtrap/MS技术，能够在低浓度下实现高灵敏度的检测，检测限和定量限分别达到0.3 ng/kg和1.0 ng/kg，显著低于传统方法的检测水平。其次，该方法通过优化提取和纯化步骤，提高了检测的准确性和重复性。例如，在提取过程中，采用0.1 mol/L盐酸溶液和EDTA-Mcllvaine缓冲液的混合提取方法，能够有效释放药物并形成稳定的螯合物，从而提高提取效率。此外，使用Oasis PRiME HLB固相萃取柱作为净化柱，不仅简化了操作步骤，还避免了柱子的激活平衡过程，提高了检测的效率和准确性。

该方法在实际应用中的效果也得到了验证。在新疆北部地区的50份牛毛样本中，检测出两份样本含有药物残留，分别为6.7 ng/kg的多西环素和4.4 ng/kg的土霉素。这表明该地区可能存在四环素类抗生素的使用，尤其是在兽医临床环境中。检测结果均处于纳克/千克（ng/kg）水平，远低于欧盟对可食用组织（如肌肉和肝脏）设定的最大残留限量（MRLs）。这一结果不仅验证了该方法的灵敏度，还表明通过牛毛进行检测可以更早地发现低剂量、长期暴露的环境或饲料药物残留问题。

从药物在牛毛中的积累机制来看，牛毛的微结构和化学组成对其药物残留的保留能力具有重要影响。牛毛主要由角质蛋白、黑色素、水分、脂质和矿物质组成，其中角质蛋白富含半胱氨酸，能够通过形成大量的二硫键，使牛毛结构更加稳定，从而减少外界因素对药物残留的破坏。黑色素不仅赋予牛毛颜色，还具有一定的药物吸附能力，有助于药物在牛毛中的积累。此外，牛毛的生长过程涉及毛囊细胞的持续分裂和角质化，使得药物能够通过“被动扩散”机制进入毛干，并与毛干中的蛋白质结合，从而在毛干中长期保留。

研究还探讨了药物在牛毛中的可能代谢途径。虽然本研究未对四环素类药物在牛毛中的具体代谢路径进行实验追踪，但基于其他药物在毛发中积累机制的研究，可以推测四环素类药物主要通过内源性途径进入牛毛。药物和其代谢产物通过血液运输至毛囊，并在毛干形成过程中整合到角质蛋白基质中。此外，外源性途径，如通过汗腺和皮脂腺的分泌物扩散，也可能对药物残留的形成产生一定影响。由于四环素类抗生素容易与金属离子（如Ca2?、Mg2?）和蛋白质结合，这种特性使其更容易通过内源性途径在牛毛中积累。

药物在牛毛中的积累还受到多种因素的影响，包括注射部位、药物使用时长和毛发生长速率等。因此，在进行样本采集时，应尽量选择干净的部位，并避免外部环境对样本的污染。此外，样本的多样性（如不同品种的牛、不同的饲养方式等）也会影响检测结果，因此未来的研究应涵盖更广泛的样本来源，以进一步验证该方法的普适性。

本研究的成果表明，牛毛作为一种非侵入性检测基质，在检测四环素类抗生素残留方面具有显著优势。其高灵敏度和长检测窗口使其成为追踪非法药物使用和评估环境健康风险的理想选择。然而，目前对药物在动物毛发中的积累机制仍存在许多未知，因此需要进一步研究以明确内源性和外源性因素对药物积累的影响。此外，针对牛毛中残留药物的可靠分析方法的开发也至关重要，以确保检测结果的准确性和可重复性。

综上所述，本研究为解决畜牧业中四环素类抗生素滥用问题提供了新的思路和技术手段。通过采用牛毛作为检测基质，不仅提高了检测的灵敏度和可行性，还为监管机构提供了新的工具，以更有效地监测和评估药物残留问题。未来的研究应进一步扩大样本规模，涵盖更多地区和品种的牛，以验证该方法的普适性，并深入探讨药物在牛毛中的积累机制，从而为制定更加科学和有效的药物监管政策提供依据。