综述：萜类合酶及其修饰酶半理性设计的研究进展

《AMB Express》：Advances in semi-rational design of terpene synthases and their modifying enzymes

本综述系统阐述了半理性设计（结合结构/序列信息与定向进化）在优化萜类合成关键酶（如萜类合酶、细胞色素P450酶、糖基转移酶等）催化效率、热稳定性及产物特异性方面的最新进展，为通过微生物细胞工厂高效合成高价值萜类天然产物提供了重要策略参考。

　　

萜类化合物在制药和保健品行业中具有极高的价值。然而，传统的制备方法日益难以满足市场对高价值萜类产品的需求。合成生物学策略的实施和微生物细胞工厂的构建，已成为大规模生产天然萜类产品的有效途径。微生物底盘用于萜类生物合成的增强，本质上依赖于萜类合酶的参与。然而，天然生物酶常因活性欠佳、催化效率有限和热稳定性不足而受到限制，这严重阻碍了萜类天然产物的生物合成效率。酶工程是推动萜类生物合成产业化的基础技术，其中，半理性设计整合了定向进化与理性设计的优势，已成为增强天然萜类合酶催化功能的一种实用且有效的策略。

异戊烯基转移酶的半理性设计

增强前体供应是合成生物学中广泛采用的代谢工程策略。牻牛儿基牻牛儿基二磷酸（GGPP）是类胡萝卜素生物合成的直接前体。为了缓解类胡萝卜素生物合成途径中的限速步骤，GGPP合酶（GGPPS）的半理性工程被证明是提高催化效率的可行方法。例如，通过对OsGGPPS1进行祖先序列分析和结构指导的突变，获得的组合突变体显著提高了催化效率和热稳定性。

单萜合酶的半理性设计

对于单萜醇龙脑的生物合成途径，通过半理性设计对截短的龙脑二磷酸合酶（LdtBPPS）进行改造，定点诱变活性口袋附近的残基，鉴定出可显著提高龙脑产量的变体。类似地，对芳樟醇合酶t67OMcLIS进行结构引导的工程改造，通过改变底物结合口袋附近的残基（如F447E），降低了空间位阻和疏水性，从而提高了酶的性能和芳樟醇产量。

倍半萜合酶的半理性设计

对α-没药醇合酶（AaBOS）和青蒿素前体合酶（AaADS）的研究，通过结构洞察和结构域交换策略，定位了负责产物特异性的活性位点。对广藿香醇合酶（PTS）进行基于结构的半理性设计，突变活性位点内的残基（如T404S, H454A），提高了广藿香醇的产量和催化效率。对（+）-瓦伦西亚合酶（CnVS, EgVS）的工程改造，通过改变底物结合口袋中的残基（如CnVS的M560L），增强了酶与底物的亲和力，从而提高了（+）-诺卡酮的产量。

二萜合酶的半理性设计

为了解决左旋海松二烯（LP）生物合成下游途径的瓶颈，对左旋海松二烯合酶（LPS）采用了半理性设计策略。基于系统发育的突变原则和底物结合口袋内氨基酸残基的鉴定，产生了各种单点突变体。组合突变（如M593I/Y700F）可显著提高二萜产量并改变产物分布。对细菌二萜benditerpenoic acid生物合成中的关键酶Bnd4的研究，通过半理性设计探索了活性位点内芳香族残基对其酶功能的影响，改变了产物谱。

三萜合酶的半理性设计

角鲨烯环氧酶（SQE）和氧化角鲨烯环化酶（OSC）是三萜生物合成途径中的关键酶。对水稻来源的OsSQE52进行基于结构的半理性设计，通过丙氨酸扫描和饱和诱变，鉴定出能显著影响β-香树脂醇合成的突变位点（如L256R）。对多种α-香树脂醇合酶（如MdOSC1, CrMAS）的半理性设计分析，阐明了关键活性位点和氨基酸残基对催化性能、产物特异性和酶-底物结合稳定性的功能意义，通过组合突变大幅提高了α-香树脂醇的产量。

四萜合酶的半理性设计

对来自布朗葡萄藻的lycopaoctaene合酶（LOS）的研究表明，通过半理性设计改变影响底物和产物特异性的关键氨基酸残基（如S276Y, A288F），可以改变其底物偏好，从而产生不同链长的烃类产物。在β-胡萝卜素生物合成途径中，通过基于进化见解对裂殖酵母Mucor circinelloides来源的双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶CrtYB的R结构域进行半理性优化，获得了能够解除番茄红素底物抑制、提高β-胡萝卜素产量和选择性的变体（如Y27R）。

细胞色素P450酶（CYPs）的半理性设计

除了萜类合酶，细胞色素P450酶（CYPs）的分子修饰也被证明可以促进产物积累。例如，对来自假单胞菌的P450cam、来自巨大芽孢杆菌的P450BM-3以及来自天仙子的莨菪碱6β-羟化酶（HPO）进行半理性设计，提高了将（+）-瓦伦西亚转化为（+）-诺卡酮的催化效率。在丹参酮生物合成途径中，对高序列同源性的CYP76AH1和CYP76AH3进行功能整合的半理性设计，通过定点诱变（如D301E/V479F）显著增强了催化效率，并整合了CYP76AH3的C11和C12羟基化及C7氧化功能。在人参皂苷生物合成中，对参与原人参二醇（PPD）转化为原人参三醇（PPT）的PgCYP2进行半理性设计，通过突变与PPD结合相关的关键残基（如I117S, T451A），提高了PPT的产量。

糖基转移酶（UGTs）的半理性设计

糖基化反应是萜类皂苷生物合成途径中的主要限速步骤。对甜菊糖苷生物合成途径中的关键糖基转移酶UGT76G1进行半理性设计优化，通过改变底物结合口袋的空间构型、极性和疏水性，增强了底物特异性和催化效率，促进了莱鲍迪苷D（Reb D）和莱鲍迪苷M（Reb M）的合成，同时减少了副产物的形成。对来自番茄的UGTSL2和来自人参的PgUGT进行工程改造，也提高了Reb D的合成效率。对三萜糖基转移酶（如Pq3-O-UGT2, UGTBL1, AmGT1, AmGT8, UGT74AC1）的半理性设计，成功优化了其区域选择性和糖供体识别能力，从而促进了人参皂苷Rg3、Rh1以及黄芪甲苷等多种三萜皂苷的高效生物合成。

乙酰转移酶、酮化酶和羟化酶的半理性设计

对紫杉醇前体巴卡亭III生物合成中的10-脱乙酰巴卡亭III 10-O-乙酰转移酶（DBAT）进行半理性设计，通过计算预测引入位于酶结合口袋和溶剂通道中的热点残基突变（如S189V），显著提高了其热稳定性和催化效率。对雨生红球藻来源的β-胡萝卜素酮化酶（HpBKT）和β-胡萝卜素羟化酶（HpCrtZ）进行基于结构建模和分子对接的半理性设计，获得的变体（如HpBKTV264D, HpCrtZN183A）在优化后的耶氏酵母中共同表达，实现了虾青素的高产。

展望

酶工程是推动萜类生物合成产业化的基础技术。随着生物信息学工具的日益完善和酶三维晶体结构的详细解析，半理性设计展现出巨大潜力。计算机和人工智能技术的进步，特别是机器学习模型，能够有效预测突变位点组合对酶热稳定性和底物选择性等复杂性状的影响，显著减轻了传统筛选方法的试错性质。这些技术的协同实施，使得通过半理性设计获得的突变体更加高效可靠，促进了设计框架内的创新，有望持续提升萜类合酶及其相关修饰酶的催化活性、热稳定性和底物特异性，并加速萜类化合物生物合成的工业化进程。