《Osteoarthritis and Cartilage》：Transcriptomic profiling confirms microRNA-140 is more functional in joint development than in disease
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miR-140-5p在骨骼发育和骨关节炎中的作用研究揭示其通过调控软骨细胞增殖分化促进正常骨骼形成，并在OA中影响骨赘形成但软骨退化作用有限，空间转录组学技术精准定位了其在静止软骨细胞和周软骨中的核心功能。
姚浩|华琳|杰米·索尔|琳恩·M·奥弗曼|史蒂文·N·利斯戈|乔纳森·考克斯黑德|卡塔兹娜·A·皮罗格|伊恩·M·克拉克|马特·J·巴特|路易丝·N·雷纳德|大卫·A·杨
英国纽卡斯尔大学生物科学研究所，生命中心，中央大道，纽卡斯尔泰恩，NE1 3BZ
摘要
目的
研究微小RNA-140（miR-140）在骨骼发育和骨关节炎（OA）中的不同作用，并利用先进的转录组分析技术识别miR-140-5p的新靶点。
方法
使用CRISPR-Cas9技术构建了一个全球性的Mir140-null小鼠模型，用于骨骼发育的表型分析和组织学研究。在骨关节炎研究中，这些小鼠接受了内侧半月板（DMM）破坏手术，通过组织学方法评估软骨损伤和骨赘形成情况，并对内侧骨骺组织进行了转录组分析。为了明确miR-140-5p在发育中的作用，我们对7天大的小鼠的肋软骨细胞进行了RNA测序，并对其后肢生长板进行了空间转录组分析，以获得基因表达变化的区域分辨率。
结果
Mir140-null小鼠表现出骨骼缺陷，包括长骨缩短和颅面畸形，这与先前的研究结果一致。生长板软骨细胞的转录组分析显示，miR-140-5p的靶基因显著上调，影响了相关通路。空间转录组分析进一步揭示了miR-140-5p在静止软骨细胞和软骨膜中的最明显功能作用。相比之下，DMM手术后，Mir140-null小鼠的软骨损伤仅比对照组略有增加，上调差异表达基因中未发现miR-140-5p的显著富集。然而，骨赘形成发生了改变，有证据表明null小鼠的骨赘发育受到延迟。
结论
miR-140-5p对骨骼发育至关重要，它通过调节软骨细胞的增殖和分化来调控软骨内骨化过程，在静止软骨细胞和软骨膜中具有独特的活性。相比之下，其在创伤后骨关节炎中的影响较为有限，对软骨退化的影响较小，但在调节骨赘形成方面起一定作用。
引言
微小RNA（miRNAs）是一类长度为20至23个核苷酸的单链内源性非编码RNA，对转录后基因调控至关重要。它们通常通过部分序列互补性与目标mRNA的3’非翻译区（3’UTR）结合，导致mRNA降解或翻译抑制[1]。由于这种结合仅部分互补，一个miRNA可以调控许多不同的靶点，使得miRNA与mRNA相互作用的预测和验证变得复杂。
许多miRNAs参与多种生物过程[2]。在骨骼系统中，破坏小鼠生长板中参与miRNA生物生成的蛋白质会导致严重的发育缺陷，包括增殖性软骨细胞数量减少和肥大分化加速，而肢体形态则不受影响[3],[4],[5]。在动物模型和人类发育过程中，已确定某些miRNA或miRNA簇是骨骼生长的调控因子。其中，miR-140是最被充分研究的富集于软骨中的miRNA。在人类中，miR-140的突变会导致一种新表型，表现为miR-140-5p功能的丧失和异常靶点调控的获得[6]。在小鼠中，Mir140的缺失会导致骨骼生长板缺陷和早发性骨关节炎（OA），而miR-140的过表达则可以防止软骨退化[7],[8],[9]。此外，miR-140在人类骨关节炎软骨中的表达也降低[8],[10]。这些观察结果表明，miR-140具有双重作用：它对正常骨骼发育至关重要，同时也在骨关节炎中起到疾病修饰作用。
为了了解miR-140如何发挥这些不同的作用，有必要在发育和退化背景下识别其体内靶点。尽管先前的研究已经确定了miR140在生长板和成人及骨关节炎软骨中的靶点，但计算机预测方法还预测了许多额外的靶点[11],[12]。在这里，我们使用CRISPR-Cas9技术生成了新的Mir140-null小鼠，系统地揭示了这种miRNA调控的靶点和通路。这些小鼠再现了之前描述的发育表型，使我们能够通过内侧半月板破坏（DMM）模型来研究生长板生物学特性和骨关节炎易感性。通过结合组织学、转录组学和空间转录组学分析，我们证明了miR-140在发育中的胫股生长板不同区域和疾病状态中调控不同的靶点集合。我们的发现揭示了miR-140的新体内靶点，并展示了空间转录组学如何确定富集于软骨中的miRNA的分子功能。总体而言，我们的数据确定了miR-140的多个新体内靶点，表明空间转录组学分析有助于揭示参与骨骼发育和疾病的基因的分子功能，并支持了骨骼发育期间形成的缺陷可能增加成年后骨关节炎发病风险的观点。
小节片段
Mir140-null小鼠的生成和表型分析
所有动物实验均根据1986年《动物（科学程序）法案》（ASPA）在纽卡斯尔大学的功能遗传学单元（FGU）进行，许可证编号为PPL60/4525和P8A8B649A。我们使用CRISPR-Cas9技术如前所述创建了Mir140的靶向缺失[13]。小鼠维持在C57BL/6J背景基因型下。基因型通过耳缘PCR确认（补充表1）。所有动物实验均符合ARRIVE标准
Mir140-null小鼠具有预期的骨骼缺陷
尽管已经描述了miR-140调控骨骼发育和骨关节炎的多个靶点[7],[30],[31],[32]，但其全部靶点谱仍不明确，尤其是在骨关节炎方面[7]。因此，为了进一步研究miR-140在骨关节炎中的靶点，我们使用CRISPR/Cas9技术生成了新的非条件性（全局）Mir140-null小鼠[13]。该技术针对全长WW结构域中E3泛素蛋白的第16和17外显子之间的miR-140位点进行了靶向删除
讨论
在这里，我们使用新生成的Mir140-null小鼠研究了miR-140在骨骼发育和骨关节炎发病机制中的作用[13]。在创伤后骨关节炎的DMM模型中，我们意外地发现其对软骨退化的影响较小，且仅在使用Pritzker等人的评分系统时才观察到这种效应[21]。尽管先前的研究报告通过相关分析或过表达方法表明miR-140具有保护作用，但我们的功能丧失数据表明
资金致谢
为了实现开放获取，作者已将本提交的手稿版本授予知识共享署名（CC BY）许可。本研究得到了医学研究委员会（Medical Research Council）和Versus Arthritis的支持，作为MRC-Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing（CIMA）项目的一部分[JXR 10641, MR/P020941/1]；Dunhill Medical Trust [R476/0516]；Versus Arthritis [19424, 22043]；JGW Patterson基金会；以及NIHR的支持
CRediT作者贡献声明
所有作者均参与了数据的设计、分析和解释。概念构思：LNR、JS、IMC、MJB、SNL和DAY。方法学：DAY、LMO、YH、KAP、HL、JC和JS。软件使用：JS和DAY。正式分析：JS和DAY。实验实施：YH、HL、LNR、LMO、KAP和MJB。资源获取：SNL和JC。数据管理：JS。初稿撰写：YH和DAY。审稿与编辑：所有作者。可视化：YH、DAY和JS。项目监督：DAY、MJB和LNR。项目管理：DAY。资金支持
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了OpenAI的ChatGPT来辅助撰写摘要并减少重复内容，并协助编写R脚本。使用该工具/服务后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。
