BTN3A3作为新型内源性磷酸抗原受体介导γ9δ2 T细胞对甲羟戊酸二磷酸的识别机制研究

《Cellular and Molecular Life Sciences》：γ9δ2 T cells detect mevalonate diphosphate via BTN3A3

本研究揭示了BTN3A3作为新型磷酸抗原受体的重要功能，发现甲羟戊酸二磷酸（MPP）能够通过BTN3A3-BTN2A1复合物激活γ9δ2 T细胞。研究人员通过分子对接、核磁共振和细胞共培养实验证实了MPP与BTN3A3的特异性结合，并发现6-氟甲羟戊酸通过抑制MPP脱羧酶导致MPP积累进而激活T细胞。这一发现拓展了我们对γδ T细胞免疫识别机制的理解，为肿瘤免疫治疗提供了新靶点。

　　

在免疫学领域，γδ T细胞一直以其独特的抗原识别机制吸引着研究人员的关注。这类T细胞能够不依赖于主要组织相容性复合体（MHC）直接识别磷酸化代谢物，即磷酸抗原（pAgs），在抗感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。然而，长期以来科学家们对γ9δ2 T细胞如何精确识别这些微小分子的机制认识有限，特别是但丙酸蛋白（BTN）家族成员在其中的具体作用尚未完全阐明。

但丙酸蛋白3A1（BTN3A1）被确认为关键性磷酸抗原受体，能够识别外源性（E）-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基二磷酸（HMBPP）和内源性二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）、异戊烯基二磷酸（IPP）。BTN3A3作为BTN3A1的同源蛋白，虽然结构相似，但其潜在功能和特异性配体一直是个谜。这种认知空白限制了我们对γδ T细胞免疫应答全面理解，也阻碍了相关免疫治疗策略的开发。

为了解开这个谜团，康涅狄格大学的研究团队在《Cellular and Molecular Life Sciences》上发表了一项突破性研究。他们发现BTN3A3能够作为一种新型磷酸抗原受体，特异性识别甲羟戊酸二磷酸（MPP），从而激活γ9δ2 T细胞的免疫应答。这一发现不仅揭示了BTN3A3的生物学功能，还为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点。

研究人员运用了多种关键技术方法开展本研究：通过等温滴定量热法（ITC）和核磁共振（NMR）分析蛋白质-配体相互作用；利用分子对接技术预测配体结合模式；采用细胞共培养系统评估T细胞激活效果；通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测代谢物水平；使用基因编辑技术构建BTN3A1敲除细胞系；并利用人外周血来源的γ9δ2 T细胞进行功能验证。

单点突变使BTN3A3获得识别磷酸抗原的能力

研究人员首先注意到BTN3A3与BTN3A1在B30.2结构域具有87%的序列同一性，但BTN3A3此前从未被发现具有磷酸抗原识别功能。通过将BTN3A3第381位的精氨酸突变为组氨酸（BTN3A3 R381H），他们成功赋予了BTN3A3识别HMBPP的能力。ITC实验显示，突变体与HMBPP的结合亲和力显著提高（K_d=0.78μM），而野生型BTN3A3的结合极弱。更重要的是，该突变体与BTN2A1形成的复合物能够有效激活γ9δ2 T细胞，其效果甚至优于经典的BTN2A1-BTN3A1组合。

分子对接揭示MPP与BTN3A3的结合潜力

基于BTN3A3可能拥有自身特异性配体的假设，研究人员通过分子对接筛选了多种磷酸抗原类似物。结果显示，甲羟戊酸二磷酸（MPP）在BTN3A3和BTN3A1的结合口袋中均获得较高对接分数。与已知的磷酸抗原不同，MPP具有更长的碳链和末端羧基，结构上区别于HMBPP。功能实验证实MPP确实能够激活γ9δ2 T细胞，尽管其效力较低（EC₅₀=300μM），远低于DMAPP（7.1μM）和IPP（30μM）。

MPP以剂量依赖方式激活γ9δ2 T细胞

研究人员系统评估了多种结构类似物的激活效力，建立了详细的构效关系。微生物来源的HMBPP活性最强（EC₅₀=0.19nM），而内源性MPP活性较弱但明确。值得注意的是，MPP的前体物质甲羟戊酸和甲羟戊酸单磷酸均无活性，表明二磷酸基团对活性至关重要。这一发现提示MPP可能通过不同于经典磷酸抗原的机制发挥作用。

MPP与BTN3A3和BTN3A1的结合验证

31P NMR实验结果提供了MPP与BTN3A3直接结合的关键证据。与IPP和DMAPP主要结合BTN3A1不同，MPP与BTN3A3的结合更为显著。当MPP与BTN3A3相互作用时，其β-磷酸基团出现明显的化学位移扰动，提示特异性结合。此外，MPP也能与BTN3A1结合，但结合模式有所不同。

BTN3A3-MPP-BTN2A1复合物的确认

研究人员通过1?F NMR技术进一步证实了BTN3A3-MPP-BTN2A1三元复合物的形成。当在?-氟色氨酸标记的BTN3A3中加入MPP和BTN2A1时，信号强度出现浓度依赖性的降低，表明形成了更大的蛋白质复合物。这一发现支持了MPP可能作为"分子胶水"促进BTN3A3与BTN2A1相互作用的假设。

6-FM通过BTN3A3和BTN3A1双重途径激活γ9δ2 T细胞

6-氟甲羟戊酸（6-FM）是MPP脱羧酶的抑制剂，其处理后会导致细胞内MPP积累。研究发现，6-FM能够有效激活γ9δ2 T细胞，且这种激活在BTN3A1敲除的K562细胞中仍然存在，表明存在BTN3A1非依赖途径。更重要的是，在CHO-K1细胞中单独表达BTN2A1和BTN3A3（不含BTN3A1）即可介导6-FM的应答，而经典的FDPS抑制剂利塞膦酸盐只能通过BTN3A1途径发挥作用。

6-FM特异性增加MPP而非DMAPP/IPP

LC-MS分析显示，6-FM处理主要导致MPP大量积累（20小时后达11μM），而DMAPP/IPP增加有限（0.67μM）。相反，利塞膦酸盐处理主要引起DMAPP/IPP积累（4.0μM），MPP水平几乎无变化。这种代谢物积累的差异完美解释了为何6-FM能同时通过BTN3A3和BTN3A1途径激活T细胞，而利塞膦酸盐仅通过BTN3A1途径。

本研究系统揭示了BTN3A3作为新型磷酸抗原受体的生物学功能，发现MPP是其特异性配体。这一发现打破了长期以来认为BTN3A1是唯一磷酸抗原受体的观念，扩展了我们对γδ T细胞免疫识别机制的理解。更重要的是，研究证实了BTN3A3-MPP-BTN2A1复合物的形成，并阐明了6-FM通过抑制MPP脱羧酶导致MPP积累进而激活T细胞的双重途径。

该研究的创新性在于首次将BTN3A3确立为功能性磷酸抗原受体，并鉴定MPP为其内源性配体。这不仅完善了γδ T细胞免疫识别的理论框架，还为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点策略。考虑到BTN家族蛋白在多种肿瘤中的异常表达，针对BTN3A3的免疫治疗策略可能为那些对传统BTN3A1靶向治疗不敏感的患者提供新的希望。

此外，研究发现的不同抑制剂（6-FM vs 利塞膦酸盐）对甲羟戊酸途径代谢物的差异化影响，也为理解代谢与免疫的交叉调控提供了新视角。这种代谢-免疫轴的特异性调控可能成为未来药物开发的重要方向。

总之，这项研究不仅解决了BTN3A3功能这一长期悬而未决的科学问题，还为开发新型免疫治疗策略奠定了理论基础，对肿瘤免疫学领域具有重要的推动作用。