TMEM43通过稳定内质网-线粒体接触位点调控线粒体能量代谢——ARVC-5致病新机制

《Cellular and Molecular Life Sciences》：The ARVC-5-associated protein TMEM43 controls mitochondrial energy metabolism by stabilising ER-mitochondrial contact sites

本研究聚焦于致心律失常性右室心肌病5型(ARVC-5)的分子机制，通过果蝇模型和人类心肌样本的多层次分析，揭示了TMEM43 p.S358L突变通过破坏TMEM43/VDAC相互作用，导致内质网/肌浆网-线粒体接触位点(ERMCSs)稳定性下降，进而引发线粒体膜电位崩溃、ROS累积和氧化磷酸化障碍，最终导致心肌细胞能量危机和病理性重塑。该研究为ARVC-5的病理生理学提供了全新视角，发表于《Cellular and Molecular Life Sciences》。

　　

在心血管疾病研究领域，致心律失常性右室心肌病5型(ARVC-5)是一种具有完全外显率的遗传性心脏病，由TMEM43基因第358位丝氨酸突变为亮氨酸(p.S358L)引起。尽管这种突变已被确认是疾病的直接原因，但其导致心肌细胞功能紊乱的具体分子机制长期以来笼罩在迷雾之中。患者常表现为危及生命的室性心律失常和右心室心肌被纤维脂肪组织替代的特征性病理改变，最终可导致心力衰竭和猝死。传统观点认为ARVC主要与细胞连接蛋白异常有关，但越来越多的证据表明，心肌细胞的能量代谢障碍可能在疾病发生发展中扮演关键角色。

为揭开这一谜团，研究人员将目光投向了进化上高度保守的TMEM43蛋白及其果蝇同源物Dmel\Tmem43。利用这种模式生物，研究团队开展了一系列精巧的实验，最终发现TMEM43在维持内质网/肌浆网与线粒体之间的沟通中起着至关重要的作用，而这一功能的破坏正是ARVC-5发病的核心环节。

本研究发表于《Cellular and Molecular Life Sciences》，通过整合果蝇遗传学模型、细胞生物学技术和人类临床样本分析，揭示了TMEM43突变导致线粒体功能严重受损的新机制。研究人员发现，正常的TMEM43蛋白能够与线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道(VDAC，又称Porin)相互作用，从而稳定内质网-线粒体接触位点(ERMCSs)。这些接触位点是细胞内部重要的通信枢纽，负责调控钙离子信号传导、脂质代谢和能量代谢等关键生理过程。

当TMEM43发生p.S358L突变后（果蝇中为p.S333L突变），这种蛋白间相互作用被显著削弱。研究人员通过免疫共沉淀和TurboID邻近标记技术证实，突变型TMEM43与Porin的结合能力大幅下降。这种相互作用缺陷导致ERMCSs稳定性降低，进而引发一系列连锁反应：线粒体膜电位(ΔΨ_m)崩溃、活性氧(ROS)水平升高、氧化磷酸化过程受阻。

研究采用的关键技术方法包括：利用UAS-Gal4系统进行果蝇组织特异性基因表达；通过免疫共沉淀和质谱分析鉴定蛋白质相互作用网络；应用TurboID邻近标记技术描绘TMEM43的微环境；采用DNA-PAINT超分辨率显微镜精确量化蛋白质共定位；使用JC-1染料评估线粒体膜电位和CellROX检测ROS水平；通过透射电镜和三维体积电子显微镜分析线粒体超微结构；人类右心室心肌样本来自一名21岁TMEM43 p.S358L携带者接受心脏移植时的组织。

Dmel\Tmem43沉淀ER和线粒体蛋白在组织特异性下拉 assays中

研究人员首先构建了表达野生型或突变型Dmel\Tmem43::HA融合蛋白的转基因果蝇，通过在肌肉组织中特异性表达这些蛋白并进行免疫共沉淀-质谱分析，鉴定出83个差异相互作用蛋白。其中39个蛋白与野生型TMEM43结合更强，44个与突变型结合更强。基因本体论分析显示，与突变型TMEM43结合减弱的蛋白主要富集于脂肪酸和能量代谢通路，许多是线粒体蛋白，尤其是Porin（VDAC的同源物）。

Porin与Dmel\Tmem43相互作用

通过在Sf21细胞中共表达Porin::HA和Dmel\Tmem43::GFP，并利用co-IP技术验证了二者间的直接相互作用。野生型TMEM43能有效共沉淀Porin，而突变型的结合能力显著降低。全蛋白质组分析排除了Porin基础表达水平差异的可能性，确认结合差异确实源于TMEM43的突变。

Dmel\Tmem43与ER/SR-线粒体接触位点的关联

为证实TMEM43定位于ERMCSs，研究采用了三种策略：TurboID邻近标记、DNA-PAINT超分辨率显微镜和线粒体-ER栓系共定位分析。结果一致表明，野生型TMEM43特异性地富集于ERMCSs，与Porin的共定位频率约为0.5%，而突变型TMEM43的共定位显著减少。

基于生物素化的邻近标记证实Dmel\Tmem43与Porin之间的相互作用

TurboID实验结果显示，野生型TMEM43的微环境中富含参与线粒体能量代谢的蛋白，包括氧化磷酸化相关蛋白。相比之下，突变型TMEM43样本中富集的则是过氧化物酶和过氧化还原酶活性相关蛋白，表明组织需要清除过多的ROS。Porin在野生型样本中的富集程度是突变型的8倍，进一步证实了突变对TMEM43-Porin相互作用的破坏。

基于DNA-PAINT的超分辨率显微镜证实Dmel\Tmem43与Porin在ER/SR-线粒体接触位点共定位

超分辨率成像显示，野生型TMEM43与Porin在ER膜上形成明显的共定位斑点，距离在20-30nm范围内，符合ERMCSs的特征。定量分析表明，突变型TMEM43与Porin的共定位频率显著降低，表明ERMCSs数量减少。

Dmel\Tmem43与线粒体-ER栓系构建体的共定位在突变肌肉组织中受损

表达线粒体-ER栓系蛋白(UAS-mito-ER)的实验发现，野生型TMEM43::HA与栓系蛋白在核周呈现强烈的点状共分布，而突变型则分布更为弥散，共定位值显著降低，表明突变型TMEM43在ERMCSs的定位受损。

Dmel\Tmem43 p.S333L影响肌肉细胞中的线粒体结构和密度

通过MitoTracker染色发现，表达突变型TMEM43的果蝇肌肉细胞中核周线粒体数量显著减少。透射电镜分析揭示了更为严重的超微结构缺陷：突变型组织中约66%的线粒体出现肿胀、外膜破裂、内部空泡化和嵴结构降解，而对照组仅有9.4%的线粒体受损。心脏特异性表达突变型TMEM43也观察到类似但较轻的线粒体异常。

人类TMEM43 p.S358L患者心肌细胞显示线粒体损伤

对一名21岁TMEM43 p.S358L携带者移植心脏的右心室组织进行三维体积电子显微镜分析发现，患者心肌细胞核周线粒体严重退化，形成约3μm宽的"线粒体空白区"，而对照心脏中线粒体与核膜的平均距离仅为0.1μm。患者线粒体体积增大，呈现肿胀状态，与果蝇模型中的发现高度一致。

Dmel\Tmem43 p.S333L导致线粒体膜电位崩溃

JC-1染料实验显示，表达突变型TMEM43的Sf21细胞中线粒体膜电位显著降低，表明线粒体去极化和功能受损。绿色/红色荧光强度比的量化分析证实了突变型TMEM43对线粒体能量状态的破坏性影响。

活性氧在表达Dmel\Tmem43 p.S333L的细胞中积累

CellROX DeepRed染色显示，表达突变型TMEM43的细胞中ROS水平显著高于野生型对照和未转染细胞，表明突变引起氧化应激增强，这可能进一步促进线粒体通透性转换孔(PTP)开放，加剧线粒体损伤。

研究结论和讨论部分强调，TMEM43 p.S358L诱导的心肌病是由线粒体功能障碍驱动的。突变通过破坏TMEM43与VDAC的相互作用，损害ERMCSs的稳定性，从而扰乱细胞器间的通信和代谢物交换。这种干扰导致线粒体钙稳态失衡、膜电位崩溃、ROS累积和氧化磷酸化效率下降，最终引发线粒体退化。心肌细胞能量供应不足促使细胞死亡和纤维脂肪替代，逐步削弱心脏功能。

该研究的重要意义在于将ARVC-5的发病机制与线粒体能量代谢障碍直接联系起来，为这一致命性疾病提供了新的病理生理学框架。传统的ARVC研究多集中于细胞连接异常，而本研究揭示了能量代谢缺陷在疾病发生中的核心作用，为开发针对线粒体功能的治疗策略提供了理论依据。同时，研究展示了进化保守的分子机制在人类疾病建模中的价值，果蝇模型与人类临床样本的高度一致性证明了这种方法的可靠性。

值得注意的是，核周线粒体在调节核钙信号和心脏功能中具有特殊重要性，本研究观察到TMEM43突变主要影响这一线粒体亚群，为理解心力衰竭的分子基础提供了新视角。未来研究可探索通过增强ERMCSs稳定性或改善线粒体功能来干预ARVC-5病程的可能性，为这种目前缺乏有效治疗手段的遗传性心脏病带来新的希望。