真菌源L-精氨酸脱亚胺酶的响应面优化及植物激素调控机制研究

《Folia Microbiologica》：Response surface methodology optimization of L-arginine deiminase from Penicillium chrysogenum and the influence of phytohormones

本研究针对微生物源L-精氨酸脱亚胺酶（ADI）易引发过敏反应且热稳定性差的问题，以真核来源的Penicillium chrysogenum为研究对象，通过响应面法优化ADI生产条件，并首次探索植物激素与多胺对酶活的调控作用。结果表明：在pH 6.0、35°C、150 rpm条件下培养6天，以葡萄糖和酵母提取物为碳氮源时ADI产量最高（20.5 U/mL）；低浓度赤霉素（GA3）和多胺可显著提升酶活。该研究为真核源ADI的规模化生产及肿瘤治疗应用提供了新策略。

　　

在肿瘤治疗领域，靶向氨基酸代谢已成为一种新兴策略。L-精氨酸脱亚胺酶（ADI）能够催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸和氨，从而消耗肿瘤微环境中的精氨酸，抑制精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的生长。然而，传统微生物源ADI（如细菌来源）存在明显的局限性：易引发过敏反应、热稳定性差，且由于原核细胞缺乏真核细胞的转录后修饰机制，其酶学性质与人体相容性较差。相比之下，真核真菌来源的ADI因其与人类酶的高度相似性，具有更低的免疫原性和更好的稳定性，但其产量和活性优化仍是亟待解决的难题。

为此，研究团队以Penicillium chrysogenum（产黄青霉）为研究对象，系统探索了其ADI生产的最佳条件及调控策略。本研究通过Plackett-Burman设计和响应面方法（RSM）优化发酵工艺，并创新性地研究了外源植物激素和多胺对真菌生长及酶活的影响。论文发表于《Folia Microbiologica》，为真核源ADI的高效生产及临床应用提供了重要依据。

研究主要采用了以下关键技术方法：1）通过Plackett-Burman设计筛选关键影响因素；2）利用中心复合设计（CCD）和响应面分析法优化培养条件；3）采用比色法（Nessler’s reagent）测定ADI酶活；4）通过干燥生物质测定评估真菌生长；5）分析植物激素（如赤霉素GA₃、茉莉酸JA）和多胺（如亚精胺、精胺）对酶活的剂量效应。实验菌株来自埃及Assiut大学菌种保藏中心（编号AUMC 14100），使用改良Dox培养基进行发酵。

生长周期与搅拌速度对生物质和ADI产量的影响

研究显示，培养6天时生物质产量（1.37 g/100 mL）和ADI酶活（10.2 U/mL）达到峰值，延长培养会导致酶活下降，可能源于营养耗尽或蛋白酶降解。搅拌速度优化表明150 rpm时氧传递效率最佳，高于此速度会因剪切力导致菌丝损伤。

接种量与pH的调控作用

接种量为2 mL时ADI产量最高（10.8 U/mL），过量接种可能导致营养竞争。pH 6.0时酶活达到最优（9.7 U/mL），酸性环境可能利于酶稳定性，而碱性条件会破坏细胞膜离子平衡。

温度与碳源的选择

35°C为最适温度，高温会导致蛋白质变性。葡萄糖作为碳源效果最佳，浓度超过0.7 g/100 mL时因葡萄糖酸积累引起pH下降，反而抑制生长。

氮源与精氨酸浓度的优化

酵母提取物为最佳氮源，其富含的维生素和氨基酸前体显著促进酶合成。L-精氨酸在0.7 g/100 mL时诱导作用最强，证实其为ADI的关键底物诱导物。

植物激素与多胺的增强效应

赤霉素GA₃（75 μM）使ADI活性提升至19.6 U/mL，多胺类（如亚精胺）通过正电荷与核酸/蛋白互作调节细胞周期。低浓度激素可能通过激活转录翻译过程促进酶合成。

Plackett-Burman设计识别关键因子

实验设计表明pH和葡萄糖浓度为最显著影响因素，其交互作用对生物质和酶活具有协同效应。模型确定最佳条件为：pH 6.0、葡萄糖0.7 g/L、精氨酸0.7 g/L、接种量4 mL、培养6天，在此条件下生物质达1.85 g/L，酶活20.5 U/mL。

响应面分析验证优化条件

3D响应面曲线显示pH与葡萄糖浓度存在显著交互作用：酸性环境（pH 4.8–5.0）与高葡萄糖（6 g/L）共同作用时酶活最高（25 U/g）。偏离该区间则活性急剧下降，表明酶对环境敏感。

本研究通过系统性优化首次证实Penicillium chrysogenum可作为真核源ADI的高效生产菌株，其酶学性质更符合临床应用需求。植物激素与多胺的调控作用为真菌代谢工程提供了新方向。未来研究可进一步探索基因工程改造和规模化发酵工艺，推动ADI在肿瘤治疗中的实际应用。