基于多临床试验队列的糖皮质激素初治杜氏肌营养不良症血清蛋白质组学生物标志物发现与验证研究

《Scientific Reports》：Circulating protein biomarkers identified in two independent clinical trial cohorts of glucocorticoid-naive Duchenne muscular dystrophy patients.

本研究针对杜氏肌营养不良症(DMD)生物标志物研究中存在的样本量小、年龄差异大、糖皮质激素治疗干扰等局限性，利用SomaScan(v4.1)高通量蛋白质组学技术分析了两个独立临床试验队列(VBP15-004和FOR-DMD)中51例4-8岁糖皮质激素初治DMD患儿及13例健康对照的7,289种血清蛋白。研究发现1,881种蛋白显著升高，1,086种蛋白显著降低，鉴定出与肌肉损伤、细胞外基质(ECM)重塑、肌肉再生和免疫炎症相关的生物标志物，并与肌肉组织mRNA表达数据进行整合分析，为DMD病理机制研究和治疗靶点开发提供了重要资源。

在罕见病研究领域，杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)一直是最具挑战性的神经肌肉疾病之一。这种X连锁遗传病以进行性肌肉无力、纤维化和早逝为特征，其根本原因是抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的缺失。尽管近年来基因治疗和药物研发取得了显著进展，但如何准确监测疾病进展、评估治疗效果仍是临床实践中的核心难题。

以往的研究主要依赖于自然史或临床护理来源的生物样本，存在年龄差异大、糖皮质激素治疗干扰等多重混杂因素。更关键的是，传统的蛋白质检测技术仅能覆盖血清蛋白质组的一小部分(如1,310种蛋白)，限制了我们对DMD全身性病理变化的全面认识。不同研究团队的结果也往往缺乏一致性，Spearman相关系数低至0.31，使得许多潜在的生物标志物无法在不同研究间得到验证。

为了突破这些局限，由Fatemeh Ahmadiharchegani等研究人员领导的多中心国际合作团队开展了一项规模空前的血清蛋白质组学研究。他们利用先进的SomaScan(v4.1)适体技术，对7,289种血清蛋白进行了全面分析，样本来源于两个严格控制的临床试验队列——VISION DMD(VBP15-004试验)和FOR-DMD试验。这些样本的特殊价值在于全部来自4至8岁未接受糖皮质激素治疗的DMD患儿，且无反复冻融史，最大程度减少了混杂因素的影响。

这项发表于《Scientific Reports》的研究揭示了令人瞩目的发现：在年轻的DMD患儿血清中，26%的检测蛋白显著升高，15%显著降低。两个独立队列间的生物标志物变化高度一致，Pearson相关系数达0.95，Spearman相关系数为0.85，显示出前所未有的数据可重复性。

研究采用的主要技术方法包括：利用SomaScan(v4.1)适体技术对7,289种血清蛋白进行高通量检测；样本来源于VBP15-004试验(51例DMD，13例对照)和FOR-DMD试验(40例DMD，15例对照)两个独立队列的糖皮质激素初治患儿血清；使用limma包进行经验贝叶斯调节检验的统计学分析；并与已发表的DMD肌肉组织mRNA转录组和单细胞核RNA测序(snRNA-seq)数据进行整合分析。

肌肉损伤生物标志物

研究发现了大量来自肌纤维损伤的蛋白质在血清中显著升高，其中35%的升高蛋白属于肌肉特异性蛋白。最引人注目的是肌小节相关蛋白的惊人升高：α-辅肌动蛋白-2(ACTN2)升高151倍，肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC1)升高86倍，快骨骼肌肌钙蛋白I(TNNI2)升高55倍，肌间蛋白-3(MYOM3)和肌间蛋白-2(MYOM2)分别升高29倍和80倍。

此外，研究还鉴定了许多新型肌肉损伤标志物，如Kelch样蛋白41(KLHL41)升高19倍，锚蛋白重复域含蛋白2(ANKRD2)升高22倍，以及多种线粒体酶类如琥珀酰辅酶A转移酶1(SCOT)升高21倍。这些蛋白在肌肉中含量丰富，其血清水平的急剧升高直接反映了DMD患儿早期显著的肌纤维破坏过程。

细胞外基质重塑生物标志物

这是第二大类的改变蛋白，包括45种升高和92种降低的细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)蛋白。卷曲螺旋域含蛋白80(CCDC80)在DMD血清中升高1.67倍，ADAMTS样蛋白1(ADAMTSL1)和血小板反应蛋白4(THBS4)分别升高2.3倍和1.5倍，反映了肌肉组织中活跃的ECM重构过程。

相反，一些细胞粘附分子如钙粘蛋白17(CDH17)降低1.65倍，骨唾液蛋白2(IBSP)降低1.69倍，表明ECM降解与肌纤维破坏并行发生。这种复杂的ECM蛋白变化模式揭示了DMD病理过程中组织重构的双向特性。

肌肉再生生物标志物

研究鉴定了38种升高和29种降低的肌肉再生相关因子。胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)升高2.81倍，膜联蛋白A1(ANXA1)升高1.8倍，而胰岛素样生长因子I(IGF-I)和IGF结合蛋白复合物酸不稳定亚基(IGFALS)分别降低1.8倍和1.66倍。

这些变化反映了年轻DMD患儿肌肉组织中活跃的再生尝试。值得注意的是，肌肉生长抑制素(GDF8)和激活素A分别降低20%和40%，可能代表了一种支持肌肉再生的代偿机制。

免疫和促炎症相关生物标志物

这类标志物仅占改变蛋白的5%，包括先前报道的趋化因子(CXCL10、CXCL11等)和新鉴定的免疫调节因子。白细胞弹性蛋白酶抑制剂(SERPINB1)升高1.5倍，白细胞介素1受体拮抗蛋白(IL1RN)升高1.2倍，而补体C3及其产物显著降低。

循环生物标志物数据与肌肉转录组数据的比较

通过将血清蛋白质组数据与已发表的肌肉mRNA表达数据整合，研究发现大多数肌肉损伤标志物在血清中显著升高(40倍以上)，但其mRNA在肌肉组织中仅轻微改变。相反，许多ECM重塑和肌肉再生因子在肌肉组织中mRNA表达显著增加，而血清水平仅中度改变。

特别值得注意的是，心肌肌钙蛋白T(TNNT2)和肌球蛋白结合蛋白H(MYBPH)在血清和肌肉组织中均显著升高，snRNA-seq数据显示这些蛋白主要表达于再生肌纤维中。补体C3在血清中降低但在肌肉中表达升高，且主要来源于纤维脂肪生成祖细胞(Fibro-Adipogenic Progenitor, FAP)，提示FAP和补体通路在DMD发病机制中的潜在作用。

这项研究通过消除糖皮质激素治疗和年龄等混杂因素，利用高通量血清蛋白质组学技术，结合发现-验证策略，鉴定了与DMD早期肌肉病理相关的全面血清蛋白生物标志物谱系。这些标志物不仅包括传统的肌纤维泄漏相关蛋白，还涵盖了参与ECM重塑、肌肉再生和免疫调节的多种因子，极大地拓展了我们对DMD全身性病理过程的认识。

研究的创新之处在于使用了高质量、治疗前的临床试验样本，两个独立队列间的高度一致性(93%的标志物变化方向一致)确保了发现的可靠性。与肌肉转录组数据的整合分析为理解循环生物标志物的组织来源提供了重要线索，特别是发现许多ECM重塑蛋白和生长调节因子主要来源于FAP细胞。

这些发现对DMD研究和临床实践具有多重意义：为疾病监测提供了丰富的生物标志物资源；揭示了新的治疗靶点，特别是与FAP细胞相关的通路；为临床试验设计提供了更敏感的药效学指标。未来通过纵向研究追踪这些标志物的轨迹，并将其与临床结局关联，将进一步推动DMD的精准医疗发展。

尽管研究存在样本量不平衡、部分补体成分测量不一致等局限性，但其大规模、多队列的设计为DMD生物标志物研究设立了新标准。随着更多正交验证方法的应用和纵向数据的积累，这些循环生物标志物有望在DMD药物开发和临床管理中发挥越来越重要的作用。