可转移性TMexCD1-TOprJ1外排泵的组装机制与NMP抑制剂的结构解析

《Nature Communications》：Assembly and inhibition of transferable TMexCD1-TOprJ1 efflux pump

本刊编辑推荐：为应对质粒携带的tmexCD1-toprJ1介导的替加环素耐药性威胁，研究者通过冷冻电镜技术解析了TMexCD1-TOprJ1外排泵及其与NMP抑制剂复合物的高分辨率结构（2.97 ?和3.0 ?），揭示了该三联体泵采用3:6:3（TOprJ1:TMexC1:TMexD1）化学计量比的独特组装模式，并发现NMP通过稳定TMexD1转运蛋白的“静息状态”构象阻断药物外排。该研究为开发针对RND型外排泵的新型抗菌药物提供了关键结构基础。

　　

在抗生素耐药性（AMR）日益严重的全球公共卫生危机中，替加环素作为对抗多重耐药菌感染的“最后防线”抗生素，其临床有效性正受到质粒携带的tmexCD1-toprJ1基因簇传播的严重威胁。这一可转移的外排泵系统属于耐药结节化细胞分化（RND）超家族，能够通过主动外排机制降低细菌细胞内药物浓度，导致治疗失败。尽管RND型外排泵在细菌固有耐药性中扮演重要角色，但人们对这种可移动遗传元件编码的TMexCD1-TOprJ1泵的精确组装机制和分子工作原理仍知之甚少。

发表在《Nature Communications》上的这项研究，通过综合运用冷冻电镜（cryo-EM）技术和细菌遗传学方法，首次揭示了TMexCD1-TOprJ1三联体外排泵的全原子结构，并阐明了其特异性抑制剂NMP（1-(1-萘甲基)哌嗪）的作用机制。研究人员成功解析了该泵在静息状态及其与NMP抑制剂复合物的高分辨率结构，发现了这一可转移耐药元件的独特结构特征和抑制作用模式，为开发逆转耐药性的新一代抗菌策略提供了重要理论依据。

关键技术方法包括：通过单质粒共表达系统获得完整的三联体蛋白复合物；采用两步亲和层析结合凝胶过滤技术纯化蛋白复合物；利用冷冻电镜单颗粒分析解析高分辨率结构；通过位点定向突变和微量热泳动（MST）分析蛋白质相互作用；使用高效液相色谱（HPLC）测定细胞内替加环素积累量；采用肉汤微量稀释法进行抗生素敏感性测定。

遗传背景与功能验证

研究首先对tmexCD1-toprJ1基因簇进行了遗传学分析，发现其排列方式与染色体编码的AcrAB-TolC和MexAB-OprM系统相似，但tolC基因在E. coli中与acrAB分离。系统发育分析将目前已发现的tmexCD-toprJ变体暂分为10个亚类。功能实验证实，携带tmexCD1-toprJ1的肺炎克雷伯菌临床分离株对替加环素和伊拉瓦环素的最小抑菌浓度（MIC）分别提高了128倍和64倍，且将该系统导入E. coli也能产生相似水平的耐药性。

TMexCD1-TOprJ1的整体结构

研究人员开发了pBAD24::tmexCD1-toprJ1单质粒表达系统，通过两步亲和纯化获得了均一的三联体复合物。凝胶过滤显示该复合物分子量约为760 kDa，负染色电镜显示其形成完整的棒状颗粒。冷冻电镜结构表明，整个复合物呈现C3对称性，高度为332 ?，直径为129 ?，采用3:6:3的化学计量比（TOprJ1三聚体:TMexC1六聚体:TMexD1三聚体）。这种对称的整体结构解释了三联体组织如何采用3:6:3的化学计量比来组装一个跨越细菌双膜的细长棒状泵。

TOprJ1外膜通道的特征

尽管序列同一性有限（19.42%），TOprJ1在拓扑结构上与E. coli TolC和铜绿假单胞菌OprM相关。在TMexCD1-TOprJ1复合物中，三聚体TOprJ1形成棒状结构的顶部，独立存在的TOprJ1也主要表现为同源三聚体。TOprJ1形成一个高度为129 ?、直径为60 ?的“环状”开放隧道，最窄处内径为18 ?。每个TOprJ1原体可结构划分为跨越外膜的β-桶状结构域和位于周质的大型α-桶状结构域。

TMexC1衔接蛋白的功能分析

TMexC1与AcrA（或MexA）具有45.08%（或41.51%）的同一性，表明其是连接TOprJ1和TMexD1的衔接蛋白。独立存在的TMexC1在溶液中形成六聚体，冷冻电镜结构显示其形成漏斗状环。TMexC1在拓扑上分为四个结构域：α-螺旋发夹结构域、脂酰结构域（LD）、αβ-桶状结构域和膜近端（MP）结构域。研究发现TMexC1的K87（可能还有K77）是推测的脂酰化位点，而C24的棕榈酰化增强了MP结构域的疏水性，这些翻译后修饰对于TMexC1的正确组装至关重要。

TMexC1与TOprJ1的“尖端对尖端”相互作用

TMexC1六聚体的中央α-螺旋发夹结构域被招募来结合TOprJ1的α-桶状结构域，两者以“尖端对尖端”的方式结合，类似于AcrAB-TolC系统。除了少量静电相互作用外，TMexC1的α-螺旋发夹和TOprJ1的α-桶状结构域（α3-α4和α7-α8）之间形成了广泛的氢键网络。功能实验证实，破坏这些相互作用的关键残基会显著降低细菌对替加环素的耐药性。

TMexD1转运蛋白的特征

作为TMexCD1-TOprJ1三联体系统中最大的亚基，内膜定位的TMexD1与AcrB和MexB具有约48.5%的同一性。不同于AcrB和MexB的不对称组织，TMexD1形成具有C3对称性的三角棱柱状同源三聚体。每个TMexD1原体由三个结构域组成：顶部对接结构域、孔道结构域和底部跨膜（TM）结构域。与AcrB的“L、T或O”状态不同，TMexD1采用一种独特的“R”（静息）状态构象，其中近端口袋和出口均关闭，阻止底物进入结合口袋。

TMexC1与TMexD1的组装

即使没有TOprJ1孔道，TMexC1衔接蛋白也能与TMexD1转运蛋白组装。在TMexCD1-TOprJ1复合物的冷冻电镜结构中，需要广泛的相互作用来维持TMexC1-TMexD1中间体的稳定性。每个TMexD1原体与两个相邻的TMexC1原体接触，其中一个TMexC1原体与TMexD1的相互作用比另一个更广泛，导致TMexC1构象略有不同。除了主要的氢键网络外，还包括静电相互作用/盐桥和疏水相互作用。

底物识别与NMP抑制机制

尽管持续努力未能获得与替加环素底物结合的TMexCD1-TOprJ1的冷冻电镜结构，但与AcrB的结构比对提示了一个推测的底物进入口袋。该预测空腔由11个疏水氨基酸排列而成，尽管TMexD1与AcrB仅有约48%的同一性，但11个空腔形成残基中有9个在TMexD1和AcrB中保守。功能实验证实，许多空腔形成残基对TMexCD1-TOprJ1机器的功能是必需的。

研究发现NMP（一种有效的RND型外排泵抑制剂）能够恢复E. coli及其相关菌对替加环素的敏感性。TMexCD1-TOprJ1与NMP抑制剂的复合物结构显示，一个NMP分子占据了位于远端口袋的连续空腔。与apo TMexCD1-TOprJ1结构相比，NMP结合结构域中的中央空腔被显著重组以更好地容纳NMP。特别是TMexD1的残基F136和F180分别经历了3.0 ?和4.0 ?的平移以适应NMP。这些发现支持了一个模型，即NMP通过模拟替加环素并稳定TMexD1转运蛋白的“R”构象来抑制可转移的TMexCD1-TOprJ1机器。

研究结论与意义

该研究通过整合结构生物学和功能分析，首次揭示了可移动TMexCD1-TOprJ1外排泵的组装机制和抑制原理。研究发现该三联体泵采用独特的3:6:3化学计量比和对称的“静息状态”构象，这与典型的RND泵不对称工作机制有所不同。重要的是，研究阐明了NMP抑制剂通过占据底物结合空腔并稳定泵的静息状态来阻断药物外排的分子机制。

这些发现不仅扩展了对可移动替加环素耐药机制的理解，而且为针对功能性外排泵的新一代抗菌药物开发提供了精确的结构模板。特别是对三联体界面和脂肪酸化位点的功能界定，揭示了这些区域作为潜在药物靶点的可能性。考虑到tmexCD-toprJ变体与关键耐药元件（如TetX6和碳青霉烯酶基因）的共现现象，针对TMexCD-TOprJ系统的有效抑制剂可能成为对抗多重耐药超级细菌的重要策略。

该研究还提出了TMexCD1-TOprJ1组装的三步模型：TMexD1在胞质中合成并插入内膜形成三聚体；周质中的TMexC1六聚体与TMexD1转运蛋白通过广泛的静电相互作用结合；插入外膜的TOprJ1通过齿轮状相互作用与TMexC1连接。这一模型为理解RND型外排泵的组装机制提供了新视角。

总之，这项研究为可移动TMexCD1-TOprJ1替加环素耐药性提供了精确的结构见解，可指导针对该外排泵的药物设计。虽然工作模型值得进一步探索，但当前发现已经为应对日益严重的抗生素耐药性威胁提供了重要的科学基础。