恶性疟原虫PSSP17在蚊媒传播中的关键作用及其作为唾液诊断生物标志物的潜力评估

《iScience》：Evaluation of Plasmodium falciparum PSSP17 essentiality in human-to-mosquito transmission and its prospective candidacy as a biomarker

本研究针对当前疟疾快速诊断试纸条(RDT)因PfHRP2/3基因缺失株出现而面临检测逃逸的困境，评估了恶性疟原虫有性阶段蛋白17(PSSP17)作为新型生物标志物的可行性。研究人员通过CRISPR/Cas9技术构建pssp17基因敲除株，发现该基因对无性血液阶段非必需，但对配子体成熟和蚊媒传播至关重要。全球19,280个基因组数据分析未发现天然缺失株，表明PSSP17具有作为唾液基RDT生物标志物的长期应用潜力，为疟疾亚临床感染检测提供了新策略。

疟疾仍然是全球重大的公共卫生问题，尽管过去几十年在控制方面取得了进展，但自2015年以来疾病负担的下降趋于平稳。一个关键的挑战是存在大量无症状的亚临床感染者，这些个体携带低密度寄生虫，无法通过常规显微镜或快速诊断试纸条(RDT)检测到，但却能感染蚊子并驱动局部传播。当前广泛使用的RDT主要靶向恶性疟原虫富含组氨酸蛋白2(PfHRP2)，然而在非洲之角和南美洲等地出现了天然缺失pfhrp2和pfhrp3(pfhrp2/3)基因的寄生虫株，能够逃避检测，导致假阴性结果。虽然存在替代标志物如寄生虫乳酸脱氢酶(pLDH)，但其敏感性较低。因此，迫切需要新的、可靠的生物标志物来改进疟疾诊断工具。

在这项背景下，研究人员将目光投向了恶性疟原虫有性阶段蛋白17(PSSP17；PlasmoDB：PF3D7_1218800)。该蛋白最初被鉴定为疟原虫分泌动合子蛋白(PSOP17)，但后续研究发现其在雌性配子体中表达和分泌，并在喀麦隆无症状儿童的唾液中被检测到。然而，PSSP17在寄生虫生命周期中的重要性尚未确定，特别是考虑到pfhrp2/3缺失的教训，任何候选生物标志物基因的必需性评估至关重要。

为了回答PSSP17是否是一个有前景的、可靠的诊断生物标志物这个问题，由B. López-Gutiérrez、N. Hathaway、L. Alonso-Palomares等作者组成的研究团队在《iScience》上发表了他们的研究成果。他们系统地评估了PSSP17对于恶性疟原虫从人到蚊传播过程的必需性，并探讨了其作为生物标志物的前景。

研究人员采用了多种关键技术方法。他们首先对全球公共数据库中的19,280个恶性疟原虫全基因组序列进行了深入的生物信息学分析，以评估pssp17基因的自然变异和缺失情况。接着，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在具有蚊媒感染能力的NF54寄生虫株中成功构建了pssp17基因敲除突变体(Δpssp17)。通过体外寄生虫培养，他们比较了野生型(WT)和敲除株在无性血液阶段的增殖速率、配子体产量以及雌雄配子体比例。最后，通过标准膜喂养实验(SMFA)评估了Δpssp17配子体感染斯氏按蚊(Anopheles gambiae)的能力，包括中肠卵囊形成率和唾液腺子孢子感染率。

全球恶性疟原虫菌株分析揭示pssp17氨基酸变化极少

研究人员对全球收集的19,280个恶性疟原虫寄生虫的全基因组序列数据进行了分析，旨在识别pssp17基因座自然发生的缺失实例。分析发现，在所有样本中均未检测到pssp17基因的自然缺失。他们鉴定出了两个主要的等位基因，其中主要等位基因与3D7实验室株匹配。在整个全球种群中，仅检测到一个频率高于1%的氨基酸变化(R194K)，出现在36.4%的种群中。还有10个其他低频氨基酸变化。这些突变位点分布在蛋白质的不同区域。两个主要等位基因存在于非洲、亚洲、大洋洲和南美洲这四大地理区域。这些数据表明pssp17是一个在全球范围内高度保守的基因。

疟原虫有性阶段蛋白17基因对无性寄生虫发育非必需但参与雌性配子体发育

尽管之前在伯氏疟原虫(P. berghei)模型中敲除pssp17同源基因的尝试失败，暗示该基因可能对无性发育必需，但近期的一项全基因组转座子突变研究提示其对恶性疟原虫非必需。本研究利用CRISPR/Cas9技术在NF54株中成功产生了两个pssp17无效突变体。研究人员观察到Δpfpssp17克隆能够产生存活的无性期寄生虫，在寄生虫血症方面没有明显差异。然而，在启动配子体发生後，他们观察到总配子体产量显著降低。这种较低的配子体血症可归因于Δpfpssp17克隆产生的成熟V期雌性配子体减少，其失去了通常在临床样本和寄生虫培养中描述的 characteristic 3-5只雌性配子体对1只雄性配子体的比例。

Δpssp17寄生虫向斯氏按蚊的传播显著减少

为了评估Δpssp17配子体成功传播给蚊子，研究人员进行了标准膜喂养实验(SMFA)。在所有三次重复感染中，与野生型NF54对照相比，在感染性血餐后8天(dpib)，Δpssp17 10F的中肠卵囊感染率平均降低了77%，Δpssp17 4D平均降低了89%。两种Δpssp17的中位卵囊感染强度均降低了100%。观察到的少量Δpssp17卵囊的"突破"出乎意料。为了确定这些"突破卵囊"是否会产生子孢子，研究人员进行了五次重复的SMFA。他们在10%蔗糖溶液中补充了0.05%的对氨基苯甲酸(PABA)以支持子孢子产生并提高蚊子存活率至喂食后第14天。使用恶性疟原虫18S rRNA端点PCR检测唾液腺子孢子感染阳性率。他们观察到，对于两种Δpssp17 10F和4D克隆，唾液腺子孢子感染阳性率平均降低了88%，这与他们观察到的卵囊感染结果一致。

本研究得出结论，理想的候选RDT生物标志物应具备三个最佳特征：抗体表位低突变性、基因稳定性（无自然缺失记录）以及由于该蛋白对无性发育和/或蚊媒传播的必需性，导致缺失突变在寄生虫种群中扩增的可能性低。本研究的数据提供了信心，表明与pfhrp2/3的情况不同，迄今为止没有pssp17缺失寄生虫存在或传播的记录。尽管观察到Δpssp17配子体能够产生少量卵囊，但其传播效率显著降低。研究表明，PSSP17对于配子体发育，特别是雌性配子体的正常成熟至关重要，其缺失会导致蚊媒传播能力大幅下降。因此，即使出现能够逃避PSSP17检测的突变寄生虫，这些寄生虫的传播也可能大大降低，这支持了PSSP17蛋白作为临床和亚临床感染的唾液生物标志物的潜在长期效用。

这项研究的意义在于，它为解决当前疟疾诊断中面临的PfHRP2/3缺失株逃逸问题提供了一个有前景的新候选生物标志物。通过严谨的基因功能验证和全球种群遗传学分析，证明了PSSP17在传播环节的必需性和基因稳定性，为其在下一代非侵入性唾液诊断技术中的应用奠定了坚实的科学基础。尤其对于检测无症状的、具有传染性的亚临床感染者，PSSP17基RDT可能成为现有诊断工具的重要补充，有助于更准确地评估传染源，从而为疟疾控制和消除策略提供关键信息。尽管将唾液作为诊断基质仍需克服社区接受度等挑战，但这项研究为开发更可靠、更易被接受的疟疾诊断方法指明了新的方向。