铜死亡相关基因TMPO通过TGF-β/Smad通路调控糖尿病足溃疡愈合的机制研究

《iScience》：Cuproptosis-related gene TMPO affects the healing of diabetic foot ulcers through TGF-β/Smad signaling pathway

本研究针对糖尿病足溃疡（DFU）难愈机制不清的临床难题，通过生物信息学筛选与实验验证相结合，首次发现铜死亡关键基因TMPO在DFU组织中高表达。团队通过体内外实验证实，抑制TMPO可激活TGF-β/Smad信号通路，显著促进成纤维细胞和角质形成细胞的增殖迁移，改善微血管生成和胶原沉积，最终加速糖尿病伤口愈合。该研究为DFU治疗提供了新的分子靶点和理论依据。

在全球糖尿病患病率持续攀升的背景下，糖尿病足溃疡（DFU）作为最严重的慢性并发症之一，正悄然成为威胁患者生存质量的"隐形杀手"。据统计，2019年全球糖尿病患病率已达9.3%，且预计到2030年将攀升至10.2%。更令人担忧的是，约10%-15%的糖尿病患者会发展为足部溃疡，这些难以愈合的创面不仅给患者带来巨大痛苦，还可能导致截肢甚至死亡——全球每30秒就有一例因DFU导致的截肢手术。尽管当前医疗技术不断进步，DFU的治疗依然面临愈合周期长、复发率高等挑战，超过40%的患者在一年内会出现新溃疡，五年内复发率高达65%。这种严峻现状迫切要求科研人员深入探索DFU的分子机制，寻找新的治疗靶点。

近年来，一种新型程序性细胞死亡方式——铜死亡（cuproptosis）引起了科学界的广泛关注。与传统细胞死亡方式不同，铜死亡与氧化应激和炎症反应密切相关，而这两者正是DFU病理过程的关键特征。特别值得注意的是，已有研究表明血液铜浓度与中国高血压伴高HDL-C成年人的糖尿病患病率呈正相关，过量铜引发的氧化还原失衡会加剧糖尿病心肌病的炎症反应。然而，铜死亡是否参与DFU的发生发展，其具体分子机制如何，这些重要科学问题尚未得到解答。

为了解开这个谜团，Wang Xiaoxiang等研究人员在《iScience》上发表了创新性研究成果。团队巧妙整合生物信息学分析与实验验证策略，通过对GEO数据库中的GSE68183和GSE68183数据集进行差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和机器学习算法筛选，发现胸腺蛋白（TMPO）是DFU中最关键的铜死亡相关基因。研究人员还创新性地构建了ceRNA调控网络，并通过单细胞转录组分析揭示了关键基因在成纤维细胞和表皮/角质形成细胞中的特异性表达模式。

在技术方法层面，本研究主要运用了生物信息学分析（包括差异表达分析、WGCNA、PPI网络构建等）、分子生物学技术（qRT-PCR、Western blot、免疫荧光等）、细胞功能实验（CCK-8法、划痕实验等）以及动物模型验证（db/db小鼠糖尿病伤口模型）。其中基因表达数据来源于GEO数据库的人类足部皮肤组织样本（GSE80178和GSE68183数据集），细胞实验采用HaCaT人角质形成细胞和成纤维细胞系，动物实验使用C57BL/6和db/db小鼠。

差异分析揭示铜死亡相关基因在DFU中的表达特征

研究人员首先对DFU组织和正常组织中的铜死亡相关基因（CRGs）进行系统分析，发现DLAT和DLD两个基因在DFU组中显著下调。蛋白互作网络分析显示这些基因之间存在复杂的相互作用，其中DLAT和DLD呈现强正相关（r=0.88），而MTF1和LIPT1则显示负相关（r=-0.7）。单样本基因集富集分析（ssGSEA）进一步表明，DFU样本的CRGs评分显著低于对照组，提示铜死亡相关过程在DFU组织中可能受到抑制。

铜死亡相关基因的潜在生物学功能

通过将DFU患者按CRGs评分分为高分组和低分组，研究人员发现940个差异表达的CRGs，其中765个上调，175个下调。GO富集分析显示，上调的CRGs主要参与ncRNA加工、染色体区域和RNA催化活性等生物学过程；而下调的CRGs则与角质形成细胞分化和低氧反应密切相关。KEGG通路分析表明，TGF-β/Smad信号通路、泛酸和CoA生物合成以及RNA降解通路是CRGs最显著富集的通路。

表达谱中的基因共表达网络

利用WGCNA构建的共表达模块鉴定出18个基因模块，其中浅青色模块与CRGs评分呈最强正相关（r=0.9）。该模块中的基因与细胞周期、RNA代谢和翻译等生物过程密切相关，而午夜蓝色模块则与CRGs评分负相关。

蛋白互作网络与单细胞转录组整合分析

将差异表达的CRGs与WGCNA共表达模块基因取交集，获得55个DFU相关的差异表达CRGs。PPI网络分析识别出NUP107、SMC2、MCM4、NUP133和TMPO五个核心基因。单细胞转录组分析表明这些基因主要在成纤维细胞和表皮/角质形成细胞中表达，这两类细胞对糖尿病伤口愈合至关重要。

DFU相关的ceRNA调控网络

通过整合miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA相互作用，构建了包含45个mRNA、19个miRNA和17个lncRNA的ceRNA网络。该网络揭示了DFU中复杂的转录后调控机制，为理解基因表达调控提供了新视角。

分子分型与免疫浸润特征

基于关键DFU基因的表达谱进行无监督聚类，将患者分为三个亚型。免疫浸润分析显示，DFU组中记忆B细胞、CD8⁺ T细胞、M0巨噬细胞和活化树突状细胞显著增加，而M1巨噬细胞和活化肥大细胞减少。ESTIMATE算法分析表明DFU组的基质评分显著降低，提示肿瘤微环境特征的变化。

表型实验验证

细胞实验证实，在高糖条件下，TMPO表达显著上调，而NUP107、SMC2、MCM4和NUP133表达下调。Western blot、免疫荧光和免疫组化结果一致表明TMPO在DFU组织和高压环境下的表达增加。功能实验显示，敲低TMPO可显著促进HaCaT细胞和成纤维细胞的增殖和迁移能力。

铜死亡相关基因胸腺蛋白的功能验证

研究人员使用Elesclomol+CuCl₂诱导铜死亡，发现细胞活力呈剂量和时间依赖性下降。铜螯合剂TTM能够特异性逆转这种细胞死亡，而其他细胞死亡抑制剂（Nec-1、Ferrostatin-1、CQ、Z-VAD-FMK）则无此效果。Western blot结果显示Elesclomol+Cu²⁺处理显著降低ACO2蛋白水平，这是铜死亡的典型特征。进一步机制研究表明，TMPO敲低可通过激活TGF-β/Smad信号通路促进糖尿病伤口愈合。

抑制胸腺蛋白可加速体内糖尿病伤口愈合

动物实验表明，通过AAV-sh-TMPO敲低TMPO表达可显著促进db/db小鼠的伤口愈合。组织学分析显示TMPO沉默增加了伤口组织的微血管密度和胶原沉积，改善胶原纤维排列，提高I/III型胶原比例，并增加表皮厚度。ELISA检测发现TMPO沉默降低促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平，同时升高抗炎细胞因子IL-10。

这项研究不仅首次建立了铜死亡与DFU之间的分子联系，还揭示了TMPO通过调控TGF-β/Smad通路影响糖尿病伤口愈合的新机制。研究结果深化了对DFU病理过程的理解，为开发针对铜死亡相关靶点的治疗策略提供了理论依据。值得注意的是，该研究创新性地将生物信息学筛选与多层次实验验证相结合，为复杂疾病的机制研究提供了可借鉴的研究范式。然而，作者也指出本研究存在一定局限性，如对TMPO上下游调控网络的解析尚不完善，未来需要进一步探索其具体作用机制。这些发现为DFU的临床治疗提供了新的思路和潜在靶点，有望改善糖尿病患者的生存质量。