综述：基于全基因组的抗菌素耐药性质粒研究的挑战与考虑因素

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Challenges and considerations for whole-genome-based antimicrobial resistance plasmid investigations

抗生素耐药性（AMR）质粒作为耐药基因（ARGs）的载体，其遗传多样性和水平转移对公共卫生构成威胁。全基因组测序（WGS）结合短/长读数据与生物信息学工具（如PlasmidFinder、MOB-suite）可辅助质粒预测、分类和传播分析，但存在采样偏差、线性质粒检测难、数据库更新不足等挑战。长读测序技术能解决重复区域和结构变异问题，但成本高且需结合短读数据优化。质粒基因组学在AMR监测中需进一步开发标准化流程和跨物种数据库。

　　抗微生物耐药性（AMR）是当前公共卫生领域面临的一个重大挑战。随着抗生素的广泛使用和滥用，细菌逐渐发展出多种机制来抵抗药物的作用，其中许多耐药基因（ARGs）位于质粒上。质粒是一种能够独立于宿主染色体进行复制的遗传元件，它们在细菌间频繁转移，使得AMR基因能够在不同物种之间传播，从而加剧了耐药性的扩散。质粒不仅携带耐药基因，还参与细菌的适应性进化，包括基因获得、丢失、结构变化以及重组等过程。然而，由于质粒具有高度的动态性和多样性，它们在基因组学研究中的识别、分类和追踪仍然面临诸多挑战。

质粒的结构和功能使其成为研究AMR的重要对象。在革兰氏阴性菌中，质粒常携带扩展谱β-内酰胺酶基因（如blaCTX-M），而革兰氏阳性菌则常携带糖肽类抗生素耐药基因（如vanA）。这些质粒的基因组序列在不同分类群之间存在显著的遗传多样性，且其数量庞大，例如PLSDB数据库在2024年5月已记录了多达72,360个非冗余质粒序列。这种多样性使得质粒在不同细菌种群之间的水平转移成为可能，从而对“最后防线”抗生素的有效性构成持续威胁。

尽管全基因组测序（WGS）已成为研究AMR质粒的重要手段，但其在生物信息学工具和数据库的应用上仍面临诸多限制。传统的质粒鉴定方法依赖于实验手段，如PCR扩增和电泳分析，这些方法不仅耗时费力，而且难以在临床环境中实现快速、准确的检测。而WGS则能够提供更全面的基因组信息，包括质粒的完整序列和基因内容，为研究AMR基因的遗传背景和传播路径提供了新的视角。然而，短读长测序技术（如Illumina）在处理重复序列和复杂基因组结构时存在局限，导致质粒的组装不完整。相比之下，长读长测序技术（如Oxford Nanopore Technologies和Pacific Biosciences）能够生成更完整的基因组组装，但也面临较高的单碱基成本问题。因此，混合测序策略，即结合短读长和长读长数据，已成为构建高质量质粒参考序列和进行基因组比较分析的常用方法。

在生物信息学分析方面，研究人员开发了多种工具来识别和分类质粒。参考型工具（如PlasmidFinder和MOB-suite）依赖于已有的质粒数据库，能够准确检测已知质粒序列，但在面对新型质粒或来自非代表性物种的质粒时存在一定的局限性。而非参考型工具（如PlasmidSPAdes和PLACNETw）则通过分析读取深度和基因组图谱来区分质粒与染色体序列，但其准确性受制于数据质量和基因组重复区域的处理能力。此外，基于机器学习的工具（如mlplasmids、RFPlasmid和Deeplasmid）在处理复杂基因组数据时表现出更高的灵活性和精度，但它们的性能高度依赖于训练数据集的多样性和质量。

质粒的基因注释和可视化也是研究AMR的关键环节。常用的基因组注释工具如Prokka和Bakta能够识别质粒中的开放阅读框（ORFs），而专门针对ARGs的筛查工具如ABRicate、AMRFinderPlus和ISfinder则用于检测特定的耐药基因和插入序列（IS）。通过这些工具，研究人员可以更全面地了解质粒的遗传内容及其在细菌适应性进化中的作用。此外，可视化工具如Bandage、BRIG和Clinker能够帮助研究人员分析质粒的结构、基因排列以及与其他基因组元素的相互作用，从而揭示AMR基因的传播模式和进化路径。

在研究质粒传播时，科学家们常常需要将短读长或长读长数据与参考质粒进行比对，以识别相似的质粒序列。这种方法通常基于SNP（单核苷酸多态性）阈值，但其准确性受制于质粒的遗传相似性和进化时间。例如，在短时爆发的耐药事件中，质粒之间的SNP差异较小，因此使用SNP阈值的方法可以较为准确地识别传播事件。然而，在长期传播或高度变异的质粒群体中，这种方法可能会失效。因此，研究者们开发了多种聚类工具，如Mash、MOB-cluster、COPLA和mge-cluster，以更有效地识别和分类质粒。这些工具通过分析基因内容、基因组图谱或序列相似性，帮助研究人员理解质粒在不同细菌种群中的传播动态。

然而，质粒基因组学仍面临一些重要的挑战。首先，质粒数据库存在显著的采样偏差，主要体现在物种分布、地理区域和生态位的不均衡。许多研究集中在Enterobacteriaceae等常见病原体上，而对其他重要病原体（如Enterococcus或Staphylococcus）的质粒研究相对较少。这种偏差可能导致对某些物种中耐药基因传播机制的误解，甚至遗漏关键的耐药质粒。此外，质粒的分类和命名方案尚未完全统一，不同研究可能使用不同的标准来定义质粒类型，这使得跨研究的比较和整合变得困难。

其次，质粒的结构多样性也带来了挑战。一些质粒具有线性结构，而另一些则是环状的。线性质粒的识别和分类比环状质粒更为复杂，因为它们的复制机制和末端结构与环状质粒不同。在缺乏长读长数据的情况下，区分线性质粒与线性化的环状质粒或断裂的染色体片段尤为困难。此外，质粒的结构变化（如大的插入或缺失）可能影响其分类和传播分析，因此需要更先进的算法来处理这些复杂的基因组特征。

另一个重要挑战是质粒在不同宿主之间的水平转移。质粒的传播不仅发生在同一物种内，还可能跨越不同的分类群，这使得研究其进化路径和传播机制变得复杂。为了更准确地追踪质粒的传播，研究人员需要结合多种生物信息学方法，包括序列比对、基因组图谱分析和网络可视化。这些方法能够帮助识别质粒的传播路径，并揭示其在不同生态位中的扩散模式。

此外，质粒基因组学在公共卫生领域的应用仍面临一些障碍。尽管WGS技术在识别和分类质粒方面表现出色，但其在临床环境中的实时应用仍受到限制。短读长测序虽然成本较低，但难以处理复杂的重复序列和长质粒。而长读长测序虽然能够提供更完整的质粒序列，但其成本较高，且在某些情况下可能无法准确区分线性质粒与染色体片段。因此，开发更高效、更经济的测序和分析方法对于提高质粒基因组学在公共卫生中的应用至关重要。

为了应对这些挑战，研究者们正在探索新的工具和方法。例如，基于机器学习的质粒预测工具能够更准确地识别新型质粒，并适应不同物种的基因组特征。此外，混合测序策略的优化和长读长测序技术的进步有望提高质粒组装的完整性和准确性。同时，建立更加全面和多样化的质粒数据库，包括来自不同生态位和宿主的质粒序列，将有助于减少采样偏差，并提高对质粒传播和进化的理解。

总之，质粒基因组学在研究AMR和细菌适应性进化方面具有巨大的潜力。然而，要充分发挥其作用，还需要克服多个技术、方法和数据库方面的挑战。通过不断改进生物信息学工具、优化测序策略以及完善质粒数据库，科学家们有望更全面地理解质粒在AMR传播中的作用，并为公共卫生政策的制定提供更可靠的科学依据。