靶向沙门氏菌青霉素结合蛋白的新型肽核酸抗菌活性研究

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Antibacterial activities of novel peptide nucleic acids targeting Salmonella penicillin-binding proteins

本研究针对多重耐药沙门氏菌感染治疗难题，开发了靶向细胞壁合成关键基因（ftsI、mrcB、mrdA）的细胞穿透肽-肽核酸（CPP-PNA）复合物。实验表明，抗mrdA CPP-PNA在体外和线虫感染模型中均表现出最强抗菌活性（MIC=2.5μM），可特异性抑制靶基因表达并引起细胞形态异常，为应对抗生素耐药性提供了新型靶向治疗策略。

　　

在抗生素耐药性危机日益严峻的今天，沙门氏菌作为全球重要的食源性病原体，其多重耐药（MDR）株的扩散使得临床治疗选择极为有限。据统计，全球每年非伤寒沙门氏菌感染导致约15.3亿病例和5.7万死亡案例，仅美国因此造成的经济损失就高达41亿美元。传统抗生素研发管线逐渐枯竭，近三十年来仅有少数新药获批，迫使科学界寻找全新作用机制的抗菌策略。

在这一背景下，反义寡核苷酸（ASO）技术因其可编程性及特异性受到关注。其中，肽核酸（PNA）凭借其稳定的伪肽骨架、抗酶降解能力及高亲和力优势，成为靶向沉默细菌必需基因的理想工具。然而，PNA能否有效穿透革兰氏阴性菌外膜是实现其抗菌活性的关键挑战。本研究创新性地将PNA与细胞穿透肽（KFF）₃K偶联，靶向沙门氏菌肽聚糖（PG）合成通路中的三个核心青霉素结合蛋白（PBP）基因——ftsI（编码PBP3）、mrcB（编码PBP1B）和mrdA（编码PBP2），试图通过干扰细胞壁合成途径开发新型抗菌剂。

为验证这一策略，研究团队首先通过生物信息学工具设计了靶向翻译起始区的10碱基PNA序列，并利用Sytox荧光染色、扫描电镜、定量PCR等技术系统评估了CPP-PNA的抗菌效果、靶点特异性及细胞毒性。沙门氏菌临床分离株（包括SL1344、Heidelberg等耐药株）和线虫感染模型被用于体内外功能验证。

主要技术方法概述

研究采用临床分离的MDR沙门氏菌株（如SL1344）及线虫（Caenorhabditis elegans）感染模型，通过以下核心方法：

1. 1.
   CPP-PNA合成与设计：基于靶基因mRNA起始区设计10-mer PNA，经(KFF)₃K肽偶联增强穿透性；
2. 2.
   抗菌活性评估：通过时间-杀菌曲线和微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）；
3. 3.
   机制验证：采用qPCR分析靶基因沉默效率，显微镜观察细胞形态变化；
4. 4.
   安全性及体内效果：通过Caco-2细胞毒性试验和线虫生存率实验评估安全性及治疗潜力。

研究结果

设计特异性靶向SL1344的CPP-PNA

通过脱靶效应筛选和理化性质优化，研究团队设计了覆盖ftsI、mrcB和mrdA基因起始密码子的三种PNA构建体（序列见表1），并设置随机序列作为阴性对照。所有PNA均通过乙烯二醇连接子与(KFF)₃K肽偶联，确保高效细菌内递送。

PNA杀菌实验

10μM CPP-PNA处理8小时后，抗mrdA组显示出最强杀菌效果（较初始菌量降低3.2 log），其次为抗mrcB（降低1.84 log）和抗ftsI组。值得注意的是，抗mrdA CPP-PNA在4小时即引起显著菌量下降，且对多种耐药沙门氏菌血清型均有效（图1A）。相反， scrambled CPP-PNA及单独CPP均无抗菌活性（图1B）。

最小抑菌浓度测定

浓度梯度实验显示，抗mrdA CPP-PNA的MIC低至2.5μM，而抗ftsI和抗mrcB的MIC均为10μM（图2A）。所有对照组（包括CPP及scrambled PNA）在20μM浓度下仍无抑制效果（图2B）。自发耐药频率实验表明，对(KFF)₃K的耐药率低于2.5×10^?10，提示该递送系统具有高遗传屏障。

反义PNA对靶基因表达的抑制

亚致死剂量CPP-PNA处理30分钟后，qPCR结果显示：抗ftsI PNA使ftsI表达降低36%，抗mrcB和抗mrdA组分别降低37%和47%（图3A-C）。非靶基因表达未受影响，证实了PNA的特异性沉默作用。

PNA对细胞形态及膜通透性的影响

显微镜观察发现，抗ftsI处理导致沙门氏菌伸长并形成丝状体（图4A.2）；抗mrcB组出现细胞裂解和分裂障碍（图4A.3）；抗mrdA组则使细菌丧失杆状形态，变为圆形巨细胞（图4A.4）。然而，Sytox染色表明CPP-PNA不破坏膜完整性（图4B），其杀菌效应源于靶向基因沉默而非物理膜损伤。

线虫感染模型验证

在感染SL1344的线虫中，抗mrdA CPP-PNA（4×MIC）使肠道菌载量减少98.7%，生存率提升至60%（图5-6E），效果与庆大霉素相当。抗ftsI和抗mrcB组也显著改善线虫生存率，但效率略低。Caco-2细胞毒性实验显示，即使4×MIC浓度下细胞活性仍保持90%以上（图S5），证明CPP-PNA具有良好的生物相容性。

结论与意义

本研究首次证实靶向PBPs的CPP-PNA能有效抑制MDR沙门氏菌。抗mrdA PNA通过干扰延伸体复合物（elongosome）功能，导致PG合成失衡和细胞形态崩溃，展现出最优抗菌潜力。该策略克服了传统β-内酰胺类抗生素的耐药机制（如β-内酰胺酶水解），为研发物种特异性抗菌剂提供了新思路。尽管(KFF)₃K递送系统依赖SbmA转运蛋白的潜在限制仍需探讨，但本研究为应对革兰氏阴性菌耐药危机开辟了基于基因沉默的精准治疗路径。