与神经发育障碍相关的Argonaute突变会导致RISC（RNA干扰复合物）形成延迟，并通过3′→5′剪切作用使miRNA异常缩短

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Neurodevelopmental disorder–linked Argonaute mutations permit delayed RISC formation and unusual shortening of miRNAs by 3′→5′ trimming

Argonaute蛋白突变ΔF180通过重排疏水核心维持RISC结构，但导致乘客链滞留和异常短小的RNA生成，揭示神经发育障碍的分子机制。

这项研究揭示了Argonaute蛋白（AGOs）突变与神经发育障碍（NDD）之间的分子机制。Argonaute综合征是一种由AGO蛋白突变引发的神经发育障碍，其具体分子机制尚未完全明确。通过冷冻电镜（cryo-EM）技术，研究人员确定了野生型AGO1和常见的、严重的ΔF180突变体的结构。研究发现，ΔF180突变体虽然改变了AGO1的L1结构域中的疏水核心，但仍然能够保持RNA诱导沉默复合体（RISC）的整体结构，并与野生型AGO1相似地识别引导RNA（guide RNA）。这一结果表明，尽管存在突变，这些蛋白质仍能形成功能性的RISC。

在功能层面，ΔF180突变体能够与目标RNA结合，但比野生型更频繁地保留乘客链（passenger strand）。这暗示了在RISC组装过程中，突变体可能在乘客链的释放上存在缺陷。进一步的生化实验显示，ΔF180和L190P突变体在双链RNA加载方面表现正常，但在乘客链的释放过程中存在缺陷。这导致引导RNA的3′末端暴露于3′→5′外切酶ISG20，从而生成异常短的约11个核苷酸的RNA片段。在细胞实验中，AGO1(ΔF180)、AGO1(G199S)以及对应的AGO2突变体（如ΔF182、G201S）均表现出类似的引导RNA截断现象。

这些发现支持了一种模型，即AGO相关NDD的病理特征可能源于乘客链释放的缺陷。当乘客链未能被有效移除时，引导RNA的3′末端会暴露于外切酶，导致其被异常剪切。这一过程可能影响miRNA的正常功能，因为miRNA通常需要较长的长度才能与PAZ结构域结合，从而完成RISC的成熟。因此，这种缺陷可能导致miRNA的失活或异常功能，进而引发神经发育障碍。

在研究中，研究人员还探讨了细胞内辅因子如伴侣蛋白对RISC组装的影响。他们发现，即使在存在ISG20的情况下，野生型AGO1仍能保持引导RNA的完整长度，而ΔF180突变体的引导RNA则被进一步剪切至11个核苷酸。这一现象在多种AGO突变体中均被观察到，包括与ΔF180相似的G199S突变体以及对应的AGO2突变体。此外，miR-124-3p这一在大脑中丰富的miRNA也表现出相同的剪切缺陷。这些结果表明，无论突变发生在哪个位置，只要影响到RISC的组装过程，都可能导致引导RNA的异常剪切，从而影响其功能。

研究人员还指出，ISG20的表达可能在特定情况下加剧这一缺陷。例如，在压力或病毒感染期间，ISG20的表达水平会显著升高，这可能导致AGO突变体所结合的引导RNA被进一步剪切，从而产生更短的RNA片段。这些异常短的RNA可能无法有效发挥miRNA的调控作用，进而影响基因表达，导致神经发育障碍的发生。此外，这种现象也可能使AGO突变体成为miRNA的“海绵”，即它们可能通过结合miRNA而干扰其正常功能，进一步加剧疾病的表现。

在讨论部分，研究人员提到，尽管这些结果表明乘客链释放的缺陷是AGO相关NDD的一个重要机制，但不能排除其他下游事件对疾病的影响。例如，突变可能影响RISC的稳定性、miRNA的靶向能力或与其他蛋白的相互作用。然而，当前的实验数据支持了一个合理的假设，即在RISC组装过程中，乘客链释放的延迟可能导致引导RNA的异常剪切，从而影响其功能，最终引发神经发育障碍。

此外，研究还强调了不同AGO蛋白之间的相似性。例如，AGO1和AGO2的突变体均表现出类似的引导RNA截断现象，这表明这些蛋白在RISC组装过程中可能具有相似的功能。同时，这些突变体在结构域位置上有所不同，但它们的共同缺陷在于无法有效完成乘客链的释放。这可能意味着，不同的突变位置可能通过影响相同的结构或功能环节，导致类似的病理效应。

从临床角度来看，这些发现为理解Argonaute综合征的分子基础提供了新的视角。由于AGO1的突变已被发现与自闭症谱系障碍（ASD）密切相关，因此，了解这些突变如何影响RISC的组装和miRNA的功能，有助于开发新的诊断方法和治疗策略。例如，如果能够识别出哪些突变会导致乘客链释放的延迟，就可以针对性地设计干预措施，以恢复miRNA的正常功能，从而减轻神经发育障碍的症状。

总的来说，这项研究通过结构生物学和生化实验的结合，揭示了AGO蛋白突变如何影响RISC的组装过程，并导致引导RNA的异常剪切。这些发现不仅有助于理解Argonaute综合征的发病机制，也为相关疾病的治疗提供了新的思路。未来的研究可以进一步探索这些突变在不同细胞类型和发育阶段的具体影响，以及它们与其他遗传或环境因素的相互作用，从而更全面地揭示神经发育障碍的复杂机制。