综述：肝脏组织工程的空间构建策略：生物制造技术及其应用

《Advanced Drug Delivery Reviews》：Spatial patterning strategies for liver tissue engineering: Biofabrication technologies and applications

肝脏组织工程通过空间调控策略（如3D打印、微流控、电纺丝）模拟肝微环境，整合肝细胞与NPCs（如LSECs、HSCs）的相互作用，以提升功能模型在药物筛选、疾病建模和再生医学中的应用。当前挑战包括材料标准化、多细胞协同调控及规模化生产，未来需结合智能生物材料与AI设计优化，并推动监管框架的适应性调整。

　　肝脏作为人体最大的内部器官，承担着多种关键的生理功能，包括代谢、合成和解毒作用，这些功能在复杂的多细胞组织中协同运作。肝脏内部的细胞结构和功能是由精确的三维空间组织所支持的，包括肝细胞与非肝细胞（NPCs）在特定位置的排列，以及这些细胞与细胞外基质（ECM）之间的动态相互作用。这种复杂的组织结构使得肝脏能够执行超过500种代谢、合成和解毒功能，从而维持生命。为了在药物开发和再生医学中应用，复制这种分层结构和动态多细胞组织是至关重要的。本文综述了生物制造策略，这些策略能够编码空间控制，以构建功能更完整的工程化肝脏组织。我们首先从天然肝脏的结构和细胞来源入手，然后评估了自组装和工程化细胞聚集体、软光刻技术、电纺纤维支架、三维生物打印以及微流体系统等方法，这些方法在模拟肝脏的生理特征，如区域化、极性以及血管或胆管网络方面的能力。此外，我们还讨论了结合多种方法的混合策略，这些策略能够提升组织的复杂性和功能。

在本文中，我们进一步探讨了如何利用人类肝脏模型来推动药物代谢和毒性筛查、疾病建模以及潜在的治疗应用。我们还分析了当前的局限性以及未来的发展方向，强调了可扩展性、可重复性和标准化方面的挑战，同时探讨了新兴的三维生物打印、机器学习指导设计以及肝脏微生理系统（MPS）的监管资格认证等机遇。工程化肝脏模型正逐渐成为连接体外和体内应用的重要桥梁，随着生物制造技术的不断进步，它们正向临床和监管转化迈进。

### 1. 引言

肝脏是人体最大的内部器官，其多种基本功能对维持代谢稳态和协调胆汁生成及内分泌调节至关重要。这些功能由集成的酶网络、膜转运蛋白和反馈回路共同执行，反映了肝脏作为身体“化学工厂”的核心作用。肝脏的功能多样性源于其分层的结构，其中肝细胞板与内皮细胞衬的窦状结构相互作用，形成微米级的微小叶（lobules），进一步聚集为宏观的段落。这种组织结构由三维排列的肝细胞和非肝细胞在细胞外基质（ECM）中形成，其组成和拓扑结构随位置不同而变化。ECM上的配体和生长因子的呈现，以及这些细胞类型之间的位置依赖性界面，稳定了极性和调节了区域特异性代谢。

尽管肝脏在维持生命方面至关重要，但终末期肝病仍然是全球发病率和死亡率的主要原因之一。肝源不足使得器官移植成为一种可行的治疗方法，但供体器官的慢性短缺促使了生物制造肝脏组织的发展，这些组织可以作为潜在的移植材料或辅助设备，以增强移植效果。同时，体外人类肝脏模型已经发展为药物筛选和疾病建模的关键平台。这些系统能够进行机制研究和临床前测试，而动物模型由于肝脏代谢、药物反应和疾病进展的物种特异性，往往难以实现这些研究目标。因此，组织工程策略已发展到再现肝脏复杂的生理特性，包括血管和胆管网络。

然而，创建超越部分结构模拟和短期功能改善的模型仍然是一个核心挑战。许多模型关注细胞类型组成，却忽略了定义肝脏功能的空间组织、ECM和信号分子的排列。空间模式在关键过程中起着基础作用，如区域化、胆小管形成和免疫调节，其缺失通常会导致极性丧失、代谢性能下降和长期稳定性差。因此，空间模式正逐渐被视为推进肝脏组织工程的关键设计原则，为编码空间信息并超越简单共培养的生物制造策略提供了充分的依据。

本文直接应对这一需求，通过将天然空间规则映射到体外设计目标，并评估当前生物制造方法如何达到这些标准。所涵盖的策略包括表面图案化、自组装和工程化细胞聚集体、纤维和微结构支架、三维生物打印以及微流体环境。虽然目前没有一种方法能够完全实现结构的精确复制，但每种方法都提供了关于肝脏结构如何指导功能的独特见解。在本综述中，我们比较了不同平台在功能分辨率、梯度控制、可扩展性/通量、可重复性和生理相关性方面的实际表现。在可用的情况下，我们还提到了典型的特征尺寸、梯度控制和功能输出，以实现不同方法之间的横向比较。

### 2. 肝脏微环境的空间组织

为了指导生物制造肝脏模型的设计，首先需要理解体内空间线索是如何组织的，因为这些自然规则为体外系统的工程化提供了基准。在健康的成年哺乳动物肝脏中，肝细胞通常以单层细胞束的形式排列，虽然有时也可以形成两层细胞板，但较厚的细胞束往往反映再生现象。窦状结构直径从几微米到几十微米不等，微小叶跨度从亚毫米到毫米级，胆小管则是在相邻肝细胞之间形成，直径约为1-2微米的连续性顶面网络。这些尺寸尺度为设备分辨率、ECM刚度和梯度幅度提供了定量目标，可作为跨平台比较的参考点。接下来的子部分重点阐述了这些组织原则在细胞、ECM和血管水平上的表现，为本节中讨论的生物制造策略奠定了基础。

#### 2.1 细胞组织

实质肝细胞形成与内皮细胞衬的窦状结构相界面，而库普弗细胞（KCs）和肝星状细胞（HSCs）则占据窦状结构和间隙（Space of Disse）中的位置依赖性小室，该小室是位于肝细胞和窦状内皮细胞之间、富含ECM的狭窄区域，促进营养、代谢物和信号分子的双向交换。这些界面是功能特异性的，而非可互换的，通过定义的配对和分离调节白蛋白和尿素合成、异源代谢、炎症阈值和再生动态。

#### 2.2 ECM结构

除了提供结构支持外，ECM还作为肝脏微环境的动态调节器。在健康的肝脏中，间隙中的低密度、基底膜样基质维持肝细胞极性和功能，支持窦状内皮细胞（LSECs）的孔隙以实现选择性渗透，并保持HSCs的静止状态。这些功能源于ECM的生化组成、机械特性和微至纳米尺度拓扑结构在窦状结构内的协调作用。

生化上，ECM在肝脏中具有空间组织性。靠近门静脉（由肝动脉、门静脉和胆管组成）的区域富含纤维连接蛋白I和III（COL I和III），而间隙中则含有纤维连接蛋白IV（COL IV）、层粘连蛋白（LM）和纤连蛋白（FN），这些蛋白具有粘附性基序。肝细胞和LSECs之间的生长因子储存如肝素结合蛋白（perlecan）在空间线索中发挥重要作用，促进ECM绑定的信号传递。关键的ECM成分及其空间相关性在表中进行了总结。

机械上，肝脏是人体中最柔软的器官之一，其模量在数百帕斯卡范围内，其基质具有粘弹性，表现为时间依赖的应力松弛。机械特性通过机械转导调节表型。HSCs在刚性塑料基质上激活，而具有适当松弛的肝脏样软基质则能维持其静止状态。肝细胞极性和胆小管网络在基质模量匹配于原生范围时被稳定，而LSECs的孔隙对刚度和表面连续性敏感。

这些ECM见解强调了生物制造策略必须编码不仅包括生化组成，还包括肝脏微环境的机械和拓扑学，因为这些维度共同影响细胞命运和功能的空间调节。

#### 2.3 血管组织和区域化

窦状结构是肝脏的定义性微结构单元。在每个微小叶中，富含氧气的动脉和富含营养的门静脉血液在门静脉区域混合，通过窦状结构衬的LSECs进行灌注，并最终汇入中央静脉。通过间隙进行的交换将血浆成分输送给肝细胞和NPCs，从而在门静脉到中央轴上形成氧气、营养和代谢物的梯度。

这些梯度驱动代谢区域化，并在肝细胞之间形成分工。靠近门静脉（区域1）的肝细胞专注于糖异生、尿素循环和β-氧化，而靠近中央静脉（区域3）的肝细胞则进行糖酵解、脂生成、谷氨酰胺合成和CYP450介导的异源代谢，包括高浓度的CYP2E1和CYP3A4。区域化还扩展到补体生产、胆汁酸合成和抗氧化防御。关键的可溶性因子及其推荐的空间递送模式，这些信息为体外设计策略提供了指导，见表中总结。

区域化源于多种空间线索的叠加。氧气和营养水平从门静脉向中央区域逐渐下降，这是由于窦状结构内的逐步消耗。微小叶的门静脉（区域1）、中央（区域2）和中央静脉（区域3）的氧气张力分别为60-65 mmHg（84-91 μM）、45-55 mmHg（63-77 μM）和30-35 mmHg（42-49 μM）。肝细胞中的Wnt/β-catenin活性在靠近中央静脉的区域最高，而门静脉区域则经历不同的内分泌和炎症微环境。剪切应力、一氧化氮（NO）和ECM组成也沿窦状结构变化，共同塑造转录程序和极化运输。

因此，构建的模型需要重现窦状结构的灌注，将梯度方向与细胞和ECM的排列对齐，并捕捉特定区域肝脏功能的动态范围。平台需要梯度生成器，具有可调节的幅度和持续时间，以稳定LSECs的孔隙和肝细胞的极性，并且读出必须验证区域特异性代谢和药物生物转化在相关时间范围内。明确报告梯度幅度（如氧气mmHg；激素浓度）将有助于有意义的基准比较。这些特性定义了自然的工程化目标，并激发了我们接下来讨论的空间生物制造策略。

### 3. 空间生物制造策略

在本节中，我们基于前文所阐述的肝脏结构和空间组织，总结了用于在体外再现这些特征的主要生物制造策略。尽管讨论了每种方法的优缺点，但核心目标是评估这些方法在多大程度上复制了天然肝脏结构和功能。为了帮助解释，我们突出了平台在分辨率、可扩展性、可重复性和生理相关性方面的比较考虑。在可用的情况下，我们还提到了典型特征尺寸、梯度控制和功能输出，以进行横向比较。表格提供了不同生物制造平台的相对优势，而其他表格则提供了本节中讨论的平台的设计特征和性能指标。在适当的情况下，我们参考了前文中的典型尺度，以帮助理解设备分辨率。

#### 3.1 工程化二维微环境

表面图案化技术在二维环境中提供精确的空间线索，使肝细胞定位和细胞-ECM相互作用得到控制，这些线索在随机分布的单层培养中通常会丢失。这些系统允许可重复地排列实质和非实质细胞，有助于在长期培养中维持肝细胞极性和功能。通过约束几何和ECM呈现，表面图案化技术填补了简单二维培养和更复杂三维系统的空白，提供了一个多功能的平台，用于机制研究和药物测试。

##### 3.1.1 微图案化共培养（MPCCs）

早期研究表明，细胞-细胞和细胞-ECM相互作用在维持原生肝细胞功能中起着关键作用。基于这些见解并利用图案化技术的进步，MPCCs被开发为一种比传统肝细胞单层和ECM夹层培养更生理相关的替代方案。Khetani和Bhatia展示了精确图案化PHH岛与3T3-J2成纤维细胞共培养，显著增强了和延长了肝细胞功能，持续4-6周。

MPCCs是通过在组织培养聚苯乙烯（TCPS）或玻璃底多孔板上涂覆ECM蛋白，通常为COL I，并应用软光刻技术生成500 μm直径的胶原蛋白区域，间距为1200 μm（中心到中心）（见图）。肝细胞选择性地附着在胶原蛋白涂层的区域，随后在非图案化区域添加辅助细胞（见图）。3T3-J2成纤维细胞在维持PHH功能方面优于原生LSECs、HSCs和KCs，至少在单层格式中；然而，这些肝脏NPCs可以与成纤维细胞结合，生成微图案化三细胞共培养（MPTCs），以更好地捕获多细胞肝脏微环境。

人类肝门成纤维细胞（PFs）最近被证明在MPCCs中比HSCs或PHH单培养更能增强和稳定PHH功能，提供了与肝脏特异性相关的平台，而非依赖于鼠源成纤维细胞来支持肝细胞。此外，MPCCs已被应用于研究非传染性疾病如代谢相关的脂肪性肝病（MASLD）和酒精性肝病（ALD）。在二维单培养中，PHHs对胰腺激素的响应迅速减弱，并表现出低CYP450活性，限制了其转化应用。相比之下，MPCCs保留了对胰岛素和胰高血糖素的敏感性，并对饮食刺激如葡萄糖、果糖和脂肪酸表现出可预测的反应。Davidson等人利用MPCCs展示了低血糖或高血糖暴露对药物代谢途径和胰岛素抵抗的影响，这与临床结果相似。随后，Davidson等人通过使用含有人类血清的生理培养基或间歇性去除牛血清和胰腺激素，发现MPCCs的寿命和胰岛素反应性可以延长，减少了成纤维细胞过度生长和脂质积累，并有效“重置”培养以实现长期维持。

将HSCs添加到MPCCs中以生成MPTCs进一步澄清了疾病机制。例如，增加MPTCs中激活（肌成纤维细胞）的HSCs数量会驱动脂肪变性和纤维化标志物的表达，同时抑制共培养PHHs的CYP450活性和胆小管形成。这些发现强调了空间控制共培养在揭示疾病相关细胞-细胞相互作用中的重要性。标准化报告MPCCs的岛屿直径、间距和NPC比例将有助于可重复性。

总结来说，MPCCs结合了微图案化的精确性与共培养的功能优势，提供了一个连接二维单培养和动物模型局限性的多功能平台。通过维持长期肝细胞功能并系统性地纳入NPCs，MPCCs直接回应了前文所述的空间组织原则，并为疾病建模和药物测试提供了基础。报告的岛屿直径和间距也为跨实验室的可重复性提供了便利的几何“操作单元”。

##### 3.1.2 ECM微阵列

虽然肝脏的天然结构是三维的，但ECM微阵列将其分解为可调节的二维系统，解耦ECM刚度和组成对细胞表型的影响。这些高通量平台向细胞展示单独的ECM蛋白、生长因子或它们的组合。Flaim和Bhatia率先将ECM斑点微打印到聚丙烯酰胺（PA）水凝胶上，这些水凝胶通常对细胞不具粘附性。细胞在这些岛屿上选择性地附着，允许在共享培养基下进行并行分析。岛屿大小和基质刚度可以调节以支持单细胞或细胞簇，从而进行系统性研究细胞-ECM相互作用。

早期研究表明，ECM组合对肝细胞命运和功能有显著影响。Kourouklis等人通过调节刚度和ECM组成来控制前体细胞的分化，使用牵引力显微镜将收缩性与肝脏谱系结果联系起来。Monckton等人发现，PHHs在25 kPa基质上，当其被单独或与LM、FN或透明质酸（HA）结合时，会增强白蛋白、尿素和CYP450酶活性；而COL IV在组合时会增强功能，但单独使用时会抑制功能，这一意外发现得益于ECM微阵列。所选的ECM组合可以长期维持PHH功能，使用与PA水凝胶共轭的96孔板。将这一平台扩展到iPSC衍生的HLCs上，发现这些细胞在1 kPa阵列上附着更好，并且在相同条件下表现出比PHHs更高的功能。LM促进了附着，而LM、FN、COL IV和COL V的组合几乎将CYP3A4表达量翻倍。

ECM微阵列还阐明了NPC表型的关键调节因素。Brougham-Cook等人展示了ECM组成和刚度如何协同控制HSCs的增殖和纤维化。将相同的方法应用于LSECs时，发现COL IV丰富的岛屿最能维持LYVE-1、VE-cadherin和CD31，而径向LYVE-1图案对基质刚度敏感。这些发现提供了关于ECM微环境如何塑造LSEC表型的见解，这是早期纤维化的重要决定因素。

总结来说，ECM微阵列提供了一种系统的方法，以研究生化和机械线索如何共同调节肝细胞和NPCs的表型，无论是在健康还是疾病状态下。通过整合ECM刚度和组成，它们补充了MPCCs，以解决微环境上下文如何调节功能的问题。包括确切的刚度值和蛋白表面密度将增强跨研究比较。

#### 3.2 自组装和工程化细胞聚集体

自组装和工程化细胞聚集体是肝脏组织工程中较早的策略之一，它们基于肝细胞和NPCs的固有空间聚集能力。这些系统比传统单层培养更能捕捉关键的细胞-细胞相互作用，并稳定肝细胞极性，因此成为更高阶空间图案化的有用基础。聚集体可以调节尺寸和组成，以平衡扩散限制与持续的活性，但形态和组织的不可控异质性仍然是一个挑战。因此，工程化方法如微图案化、声学组装和微流体封装被用来施加额外的空间控制。

##### 3.2.1 聚集体

聚集体是通过强细胞-细胞相互作用形成的三维固体细胞聚集体。它们高度功能化，并被广泛用于建模疾病和预测药物毒性。传统上，它们是通过非粘附孔板、悬挂滴培养或旋瓶培养形成的。其直径因制造方法而异，通常在50到400微米之间。较大的聚集体缺乏血管化，通常由于氧气和营养的扩散限制而形成坏死核心。肝细胞单培养聚集体保留了基本功能，但与肝脏或非肝脏NPCs（如3T3-J2小鼠胚胎成纤维细胞或间质干细胞（MSCs））共培养可以进一步增强肝细胞活性。人类PFs，但非HSCs，也能增强PHH聚集体功能。尽管有这些优势，聚集体缺乏空间取向和可控的架构，导致极性和长期功能的变异性。这促使工程化努力以增强聚集体的尺寸、组成和位置控制。

制造策略强烈影响聚集体的形态和功能。微图案化提高了尺寸和形状的控制，减少了与传统方法相比的变异性。图案化已被成功应用于增殖性肝细胞系，这些细胞系扩展为尺寸和形态一致的聚集体。由于PHHs在标准培养条件下不增殖，这种方法不直接适用；然而，预形成的PHH聚集体可以被固定在修饰的二维表面或放置在微图案化区域以标准化其排列。将聚集体图案化在三维支架中提供了另一种施加空间秩序的方法。例如，Zhang等人将多能干细胞（PSC）衍生的HLCs在猪肝脱细胞基质（dECM）水凝胶中封装，并将其播种到六边形图案化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）结构中。只有图案化的HLC-HUVEC构建体表现出显著的功能增强，强调了空间排列和共培养的双重重要性。

声学生物组装为聚集体图案化提供了一种非侵入性的替代方法，无需软光刻。声学悬浮已被证明可以生成维持功能的肝细胞聚集体，即使在长期培养中也能保持其功能。虽然与传统方法相比通量较低，但声学系统可以产生更高的功能，尽管在PHHs中的验证仍有限。Gu等人利用声学差分生物组装将HUVEC液滴和HLC聚集体排列成类似小叶的结构，分泌白蛋白和尿素至少六天。Li等人利用声学全息技术在明胶-甲基丙烯酸酯（GelMA）格子中形成图案化的PHH聚集体。这种“声学全息格子”（AHL）模型在白蛋白、尿素、α-1抗胰蛋白酶、forkhead box A2（FOXA2）、转铁蛋白和药物介导的CYP450诱导方面优于二维和三维对照，强调了声学方法在肝脏模型中的潜力。

其他策略提供了更精细的空间或组成控制。微流体流式细胞术打印可以实现均匀的聚集体制造，具有定义的尺寸、活性和组成。尽管减少了变异性，但相关剪切应力可能损害肝功能，这一问题尚未完全验证。DNA折纸支架可以引导多种细胞类型的精确空间定位。Wei等人利用胆固醇标记的纳米结构模拟粘附分子，创造了一种“NAC”（核酸纳米结构修饰的活细胞）聚集体，具有可定制的布局，可以用于在核心和周围壳层中共培养不同细胞类型。这些肝细胞-NPC聚集体至少维持了28天的功能，并表现出ASGPR的更高表达，这是一种肝细胞成熟标志物，显示了比传统聚集体更高的空间控制能力。

基因工程还提供了一种编程聚集体架构的方法。通过调节Gata6水平，人类多能干细胞（PSCs）产生了异质性肝芽样组织。CRISPR介导的转录因子激活改善了血管化，但空间控制仍然有限。Toda等人开发了一个合成Notch（synNotch）系统来驱动双层聚集体形成，其中钙粘蛋白表达决定了细胞类型内外层的排列。结合synNotch与微图案化进一步实现了编程分化和增强结构复杂性。

总结来说，聚集体展示了肝细胞和NPCs的固有自组装能力，但需要添加空间线索和运输控制来克服扩散限制并维持极性。整合微图案化、声学方法、微流体、DNA折纸或基因工程可以提高空间保真度和功能相关性，直接回应了前文所述的细胞组织挑战。典型的功能输出，包括白蛋白分泌、尿素合成和CYP450活性，已在表格中进行了总结，为后续章节中的性能比较提供了上下文。

#### 3.3 电纺纤维支架

电纺技术广泛用于生产用于组织工程的纤维支架。通过调节电纺参数，如溶剂选择、聚合物粘度、施加电压和收集器设计，可以影响纤维形态和排列。这些因素的调节使得能够生成直径从纳米到微米的支架，包括通过高速旋转收集器形成的对齐纤维。

电纺纤维可以提供一种模拟天然ECM的环境，促进肝脏细胞的生长。Liu等人展示了由猪肝脱细胞基质（LdECM）制成的纳米纤维显著增强了PHHs的功能。来自胶原蛋白、壳聚糖、LdECM或其混合物的纳米纤维在白蛋白分泌、尿素合成和CYP450活性方面优于其他ECM支架。同样，Gao等人将LdECM与聚己内酯（PCL）结合，创造出混合纤维（230-580 nm），提高了肝细胞的附着、增殖和标记物如白蛋白、CYP1A2、肝细胞核因子（HNF）4α和纤连蛋白的表达。

纳米纤维拓扑学进一步调节肝功能。Feng等人展示了不连续对齐纳米纤维如何引导肝细胞极性、细胞骨架组织和胆小管形成。Maymand等人报告了在对齐纳米纤维上培养的iPSCs表现出比随机对照更高的肝分化。对齐效应也在原生小鼠肝细胞和HepG2s中观察到，尽管Bate等人发现细胞反应的高变异性取决于纤维孔隙率和方向。

尽管电纺技术提供了有价值的结构和生物线索，但复制肝脏的多尺度结构需要与其他互补的图案化策略结合。将纤维支架与微图案化共培养、聚集体和水凝胶结合，可以将纳米尺度的拓扑学指导与多细胞组织结合。这些方法虽然在分辨率、细胞活性、材料兼容性和通量之间存在权衡，但通过结合自组装和工程化策略，可以提高空间保真度和功能相关性。未来挑战是生成整合肝脏、血管和胆管腔的构造，同时支持体外和体内的长期、多区域功能。

### 3.4 三维生物打印

与依赖自组装或受限支架的聚集体、类器官和微组织相比，三维生物打印提供了直接的空间控制，使肝组织的制造具有高精度和组织化结构。主要的生物打印模式包括喷墨、挤出、立体光刻和激光辅助打印，每种模式在分辨率、活性、材料兼容性和通量之间进行权衡。挤出支持高细胞密度和聚集体沉积，而喷墨则在细胞浓度上受到限制。立体光刻能够快速、高保真度地制造特征，但可能带来紫外线相关的细胞毒性。激光辅助方法提供了最高的分辨率，但仍然复杂且不太可扩展。

生物打印的核心在于生物墨水，它们模仿ECM同时保持可打印、稳定和生物相容性。天然聚合物，如胶原蛋白、明胶、藻酸盐、透明质酸和脱细胞基质（dECM）提供了生物活性，而基于聚乙二醇（PEG）的合成材料则提供了可调节的机械特性。策略如粘附肽、生长因子结合和优化交联进一步增强了仿生特性。

最近的生物打印技术进展使得能够实现越来越复杂的空间策略，以复制肝脏的微架构和多细胞组成。Kang等人开发了一种预设的挤出生物打印技术，使用前体储库来保持多种材料在预定义配置中，制造了具有中心腔和高细胞密度的多尺度肝小叶。明胶基生物墨水支持了肝细胞-内皮细胞相互作用，导致白蛋白分泌和CYP450活性增强，优于无组织的对照。Wu等人利用含有纤维素纳米晶体的剪切变稀生物墨水将肝细胞和成纤维细胞图案化为六边形，提供了几何约束和旁分泌线索，促进了肝细胞成熟。为了重建血管界面，Taymour等人采用了核心-壳层生物打印，通过共轴打印肝细胞和内皮细胞，生成类似窦状结构的通道。补充这一方法，与牺牲墨水打印兼容的自愈水凝胶被用来生产可灌注的血管，提供了可承受长期培养的稳定通道，能够实现营养和代谢物的可控运输。除了血管化，细胞密度和组织也已成为功能的关键决定因素。Lu等人展示了高细胞密度生物打印如何通过YAP/TAZ信号保持极性和增强肝功能，强调了机械转导的作用。Subramaniam等人进一步证明了肝细胞和成纤维细胞的共培养“圆盘”能够再现类似区域化的代谢梯度和长期肝功能，突显了空间组织的异质性相互作用的重要性。

总结来说，与MPCCs和ECM微阵列相比，这些方法在二维组织方面表现出色，三维生物打印则在三维中提供了直接的空间控制，结合了结构保真度与生化和机械线索。电纺纤维支架提供了ECM样纳米尺度拓扑学，但缺乏对精确多细胞分隔的相同能力。因此，生物打印提供了更高的建筑精度，而纤维支架则贡献了互补的引导线索。然而，分辨率、细胞活性、材料兼容性和通量之间的权衡仍然存在，强调了混合方法的必要性。未来的挑战是生成整合肝、血管和胆管腔的结构，以实现体内和体外应用的长期、多区域功能。

### 3.5 微流体平台

肝脏芯片技术的进步使得能够构建空间导向的平台，整合多细胞组织、区域化梯度和动态流，从而更好地再现体内生理。设计范围从分隔的共培养到具有氧气梯度和可灌注血管的仿生小叶。空间排列、ECM整合和施加的剪切应力是促进活性和功能的关键因素。在本节中，我们将平台按主要空间目标分组：（i）流条件化的聚集体，（ii）小叶样结构，（iii）区域化芯片，以及（iv）管化血管/胆管模型。

一种方法是利用微流体将聚集体置于流中，其中剪切应力增强了结构和代谢特性。例如，Zheng等人开发了一种五层三维多细胞肝脏芯片（3D-DMLoC），在不同隔室中共培养HepaRG聚集体和HUVECs，动态流增加了紧密连接（ZO-1）、转运蛋白表达（MRP2）、白蛋白、尿素和CYP50活性，优于静态对照。然而，由于需要每个聚集体的独立蠕动泵，其通量受到限制，强调了可扩展并行化的必要性。

其他设计模仿肝小叶，结合门静脉和中央静脉几何结构与异质性相互作用。Du等人工程化了一种芯片，其中HepaRG、LX-2（转化的HSC系）和LSECs通过重力驱动的梯度灌注，支持了肝细胞束、窦状网络和微绒毛/孔隙的形成。同样，Ya等人展示了通过门静脉灌注的区域化氧气输送如何稳定血管网络并增强代谢活性。这些模型捕捉了小叶样组织，但仍受到缺乏胆管出口和不完全使用原生细胞的限制。

微流体还被用于复制肝脏区域化。Mahdavi等人创建了一种区域化芯片（ZoC），其中HepG2s暴露于氧气梯度（从19%到3-5%），产生了相应的白蛋白梯度。Kang等人扩展了这一概念，通过激素梯度再现区域化氮代谢和异源代谢。虽然这些方法具有信息性，但大多数设备一次只复制一个或两个梯度，而生理区域化（见前文）是由门静脉输送的氧气、营养、激素和肠道衍生因子的整合作用产生的。捕捉这种组合信号对工程化平台至关重要，因为孤立的线索往往无法再现区域化肝表型的完整谱系。

流体平台还被用于整合可灌注腔和血管化结构，以增强肝脏芯片的功能。Chhabra等人开发了SHEAR（结构化血管化肝集合体用于分析再生）芯片，其中包含一个纤维通道，周围是PHH/成纤维细胞聚集体，并随后被内皮细胞（HUVECs）内皮化。该设计支持血管内皮生长因子（VEGF）和肝细胞生长因子（HGF）分泌，并且能够进行IL-1β驱动的损伤研究。Ozkan等人应用了一种分层架构，将肝细胞、星状细胞、内皮细胞和巨噬细胞嵌入到肝癌芯片中，以研究与肝硬化相关的药物反应。进一步发展这一设计，Ferrari等人创建了包含HUVECs的可灌注通道，与PHHs的胶原蛋白载荷相结合，改善了白蛋白生产和CYP3A4活性。Wang等人进一步扩展了这一概念，通过将内皮化腔与新生血管化结构连接，能够研究尼古丁诱导的血管通透性和CYP450抑制。然而，依赖HUVECs而非LSECs降低了生理保真度。

互补的进步集中在胆管系统，其中微流体已被用于创建在传统二维培养或三维类器官中无法实现的胆管模型。Du等人首先制造了一个单一的胆管通道，其衬有极化的原生小鼠胆管细胞，其中屏障通透性取决于实现超汇合的上皮单层。他们后来扩展了这一方法，开发了一种双通道微流体设备，整合了平行的胆管和血管通道，允许在生理或病理条件下进行屏障功能和相互作用的可控分析。同样，Smith等人工程化了一种微流体芯片，包含两个胆管通道，生成了一个相互连接的肝内胆管系统，显示纤维素维持了胆管的完整性，优于Matrigel-胶原蛋白I。这一平台在一周内维持了胆管网络和新生分支，但长期稳定性和功能验证仍有限。展望未来，微流体胆管模型可以被修改以量化分支动力学、进行小分子追踪，并整合肝细胞以研究胆汁酸运输，从而提供更全面的胆管生理和病理表征。

总的来说，这些微流体平台展示了如何通过几何、梯度和灌注来维持功能，超越了静态聚集体、类器官或支架系统的局限性。与MPCCs或ECM微阵列相比，这些平台强调了控制二维组织，而电纺支架提供了ECM样纳米尺度拓扑学，但缺乏对精确多细胞分隔的相同能力。因此，微流体提供了独特的动态流与三维空间保真的结合。然而，分辨率、细胞活性、材料兼容性和通量之间的权衡仍然存在，强调了混合方法的必要性。未来的挑战是生成整合肝、血管和胆管腔的构造，在解剖相关配置中支持体外和体内的长期、多区域功能。

### 4. 集成生物制造用于治疗和疾病建模

由于没有一种制造方法能够完全复制肝脏的复杂性，最近的研究重点在于整合互补的策略，以构建服务于治疗和体外应用的模型。一种常见方法是使用细胞聚集体作为模块化构建块。三维生物打印的聚集体或“生物组装”允许其精确放置，同时保护细胞免受打印过程中的剪切应力。

#### 4.1 治疗应用

一个重要的治疗应用是工程化植入组织以应对肝衰竭。例如，Li等人生物打印了HLCs的聚集体，形成了一种基于GelMA的结构，其在移植后维持了更高的活性和更持久的功能。在急性肝衰竭的小鼠模型中，这种结构拯救了小鼠，展示了在60天内新生血管化和肝表型维持。同样，Skardal等人开发了一种模仿肝脏机械特性的生物墨水，用于打印原生肝细胞聚集体，这些聚集体在两周以上表现出稳定的功能。由于其弹性模量可调节，该系统还可以模拟纤维化硬化。虽然这对再生医学具有前景，但将结构扩展到人类相关大小和细胞密度需要提高功能性肝细胞的高通量扩展和稳健的预血管化策略。定义预指定的目标剂量（细胞/公斤）、血管化指标和植入后的存活时间将有助于明确转化的准备程度。

#### 4.2 预测毒性

除了治疗移植外，基于聚集体的系统还被用于预测毒性。Bouwmeester等人共打印了胆管衍生的肝类器官和牺牲水凝胶，生成了多孔结构，通过活性丧失和微RNA-22的产生检测了对乙酰氨基酚的毒性。Kim等人生物打印了原生肝细胞聚集体，并与dECM结合，展示了该模型在预测三种肝毒性药物的IC50值方面的优越性，优于传统聚集体或二维培养。这些头对头的比较强调了先进制造方法在构建可靠药物测试平台中的转化价值。将体外动力学与基于生理的药代动力学（PBPK）参数联系起来将进一步加速采用。

#### 4.3 复杂疾病建模

混合生物制造策略还通过在控制的空间排列中组织多种细胞类型，使建模复杂肝病成为可能。例如，Cho等人使用微流体平台嵌入多谱系聚集体（肝细胞、HUVECs、KCs和HSCs），以建模MASLD，捕捉了纤维化表型和疾病进展。Hong等人结合挤出生物打印与微流体打印，生成了在结构化排列中的HepG2-HUVEC聚集体。内皮“束”穿过肝聚集体，表明了在血管化中的可扩展策略，但需要与原生细胞或HLCs进行验证。这些研究展示了混合方法如何通过空间层叠多种细胞类型来捕捉疾病建模中关键的多细胞相互作用。未来迭代应报告细胞-细胞界面几何和配体呈现，以将结构与功能联系起来。

其他混合策略针对胆管系统，其中微流体已被用于创建无法在传统二维培养或三维类器官中实现的胆管模型。Du等人首先制造了一个单通道的胆管模型，在胶原蛋白凝胶中衬有极化的原生小鼠胆管细胞，其中屏障通透性取决于实现超汇合的上皮单层。他们后来扩展了这一方法，开发了一种双通道微流体设备，整合了平行的胆管和血管通道，允许在生理或病理条件下进行屏障功能和相互作用的可控分析。同样，Smith等人工程化了一种微流体芯片，包含两个胆管通道，生成了一个相互连接的肝内胆管系统，其中纤维素