用于评估人类TNF-α中和抗体的常见效价测定的比较分析

《animal》：Comparative Analysis of Common Potency Assays for Assessing Human TNF-alpha Neutralising Antibodies

抗TNF-α单抗的L929细胞毒性和HEK293 Blue NF-κB报告系统评估显示，前者揭示后期凋亡和代谢紊乱，后者在灵敏度、重复性及高通量检测中更具优势，建议双平台联合检测。

　　肿瘤坏死因子α（TNF-α）作为炎症和自身免疫性疾病中的关键因子，其在病理过程中的作用日益受到关注。近年来，随着生物制药行业的不断发展，针对TNF-α的单克隆抗体（mAbs）已成为治疗多种疾病的重要手段。这些抗体不仅在临床应用中表现出显著的疗效，而且在基础研究中也发挥着重要作用。然而，为了确保其功能的准确性和可靠性，对这些抗体的性能评估显得尤为重要。本研究系统地评估了来源于杂交瘤细胞的抗人TNF-α单克隆抗体在两种广泛采用的体外功效检测方法中的表现：基于细胞毒性的L929成纤维细胞检测法和基于NF-κB报告系统的HEK293 Blue细胞检测法。通过分析中和效率、信号可重复性和检测灵敏度等指标，我们发现这两种检测方法在IC50值上表现相近，但各自在动态范围、灵敏度和生物学相关性方面存在差异。HEK293 Blue细胞检测法在早期TNF-α信号检测中表现出快速、稳定且高通量兼容的特点，背景信号低，结果重复性高。相比之下，L929细胞检测法则更能够反映TNF-α信号在生理条件下的后期效应，如细胞凋亡和代谢紊乱。此外，使用CellTiter-Glo?试剂进行ATP定量检测被证明是一种实用且灵敏的细胞活力评估方法，但其他代谢和膜完整性检测方法可能在解释结果时提供更全面的信息。研究结果强调了这些检测平台的互补优势，并支持采用双检测方法进行全面评估抗TNF-α抗体的功能特性。

单克隆抗体是当前治疗蛋白中增长最快且最显著的子类。在2010至2014年间，其在全球首次药物批准中的占比为27%，而2015至2018年间这一比例上升至53%。近年来，这一趋势仍在持续，生物制药行业在推进治疗性抗体开发方面的努力取得了越来越多的成功。在单克隆抗体开发过程中，质量控制阶段是至关重要的环节，它在临床前验证之前进行，用于评估抗体的疗效和功效。在这个阶段，通常会采用一系列体外检测方法，大致可以分为两大类。

第一类检测方法主要是分析性的，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、表面等离子共振（SPR）、生物发光干涉（BLI）等技术。有时还会结合流式细胞术、免疫荧光显微镜和其他生物传感器技术。这些方法对于确定抗体与目标抗原之间的亲和力和特异性至关重要，同时还能提供抗体-抗原相互作用的动态数据，如结合速率和解离速率。第二类检测方法则是基于细胞的，用于评估抗体的生物学活性。根据抗体预期的治疗作用，这些检测可能包括对抗体介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）、补体依赖性细胞毒性（CDC）、细胞增殖、细胞活力、细胞凋亡、受体内化、报告蛋白分泌、细胞因子释放等功能参数的评估。

评估抗体中和能力的方法通常包括上述检测之一或多种。这些检测可以使用目标细胞本身，也可以使用经过工程改造的报告细胞系。目前，许多生物技术公司和实验室已经开发了多种单一目标（特异性）的细胞系，例如Promega公司的Membrane TNFα Target Cells和GloResponse? NFAT-RE-luc2P HEK293细胞系，以及ATCC提供的U-937 NFκB-LUC2和KG-1 NFκB-Luc2细胞系，还有InvivoGen提供的HEK-Blue? TNF-α和HEK-Blue-Lucia? TNF-α细胞系，以及Novus Biologicals的TNF-α Prom/LUCPorter?细胞系等。这些细胞系的广泛应用，使得对TNF-α中和能力的评估更加系统和高效。

然而，无论细胞系的来源如何，单一细胞类型都无法全面反映抗体的功能特性。某些细胞因子即使在被抗体结合后，仍可能在特定细胞类型和环境条件下表现出不良作用，这揭示了抗体或细胞因子/抗体复合物功能的异质性以及组织特异性效应。因此，为了克服体外分析的局限性，建议在评估抗体功效时使用至少两种不同的报告细胞系。这种方法能够更全面地评估抗体的功能特性，提高结果的可靠性和稳健性。

TNF-α与两种特定的受体结合，即TNFR1和TNFR2。这两种受体在单独或共同作用时，可以引发不同的组织特异性反应。TNFR1通常激活促炎信号通路和细胞死亡途径，而TNFR2则由于缺乏死亡结构域，主要促进细胞存活、增殖和组织再生。因此，TNF-α的刺激效果不仅取决于其自身的表达水平，还受到其依赖信号通路中其他成分的影响。这种复杂性使得仅依赖中和抗体来完全抑制这些过程变得困难。为了提高治疗效果，抗TNF-α抗体常常与其他因素结合使用，例如针对干扰素γ（IFN-γ）的中和抗体，以实现对炎症通路的更全面阻断。这种联合治疗策略已被成功应用于SARS-CoV-2感染的小鼠模型中，通过抑制细胞因子风暴和败血症显著降低了死亡率。此外，通过破坏生物活性的TNF-α三聚体或特异性靶向TNFR1或TNFR2的抗体也已被广泛测试。同时，一些天然化合物，如多酚、黄酮类和萜类物质（例如人参皂苷、白藜芦醇、姜黄素和表没食子儿茶素没食子酸酯）在多种疾病模型中被广泛研究，以评估它们对TNF-α介导通路的抑制作用，包括皮肤老化性炎症、神经炎症和自身免疫疾病、类风湿性关节炎以及代谢性疾病等。

在本研究中，我们选择了两种TNF-α报告细胞系，即L929细胞和HEK-Blue? TNF-α细胞，以系统地比较抗TNF-α抗体的中和能力。通过这些细胞系的检测，我们不仅评估了抗体的功能特性，还优化了未来类似研究的实验方案。L929细胞作为天然的TNF-α响应细胞，仍然是TNF-α研究中最常用的模型之一。然而，其他未经工程改造的细胞系，如人类成纤维样滑膜细胞（HFLS）和人类类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞（MH7A），同样表现出对TNF-α的敏感性，为研究TNF-α介导的反应提供了有价值的模型。

本研究采用的抗人TNF-α单克隆抗体来源于早期TNF研究中生成的杂交瘤细胞。这些杂交瘤细胞是由小鼠骨髓瘤NS0细胞与免疫过Balb/c小鼠的脾细胞融合而成，脾细胞曾被高度纯化的TNF-α免疫过。细胞毒性实验表明，这些杂交瘤细胞产生的单克隆抗体具有显著的中和能力。研究结果进一步证实了这些抗体在与随机选择的其他抗体进行比较时的稳健表现。这一发现不仅为抗TNF-α抗体的开发提供了理论依据，也为未来的临床应用和研究奠定了基础。

在评估抗TNF-α抗体的性能时，除了考虑其中和能力外，还需要关注其在不同检测平台上的表现。HEK293 Blue细胞系作为基于NF-κB报告系统的检测平台，能够快速、稳定且高通量地检测早期TNF-α信号事件。这种检测方法具有低背景信号和优异的可重复性，适合用于大规模筛选和高通量实验。而L929细胞系则能够提供关于TNF-α信号后期效应的生理学相关信息，如细胞凋亡和代谢紊乱。尽管L929细胞系的检测周期较长且结果可能具有一定的变异性，但其在揭示抗体在生理条件下的长期作用方面具有不可替代的价值。

为了更全面地评估抗TNF-α抗体的功能特性，我们采用了这两种不同的检测方法。通过对比分析，我们发现HEK293 Blue细胞系在检测早期信号事件方面表现出更高的灵敏度和可重复性，而L929细胞系则在揭示TNF-α信号的后期效应方面具有更强的生物学相关性。这种互补性的优势使得采用双检测方法成为评估抗TNF-α抗体性能的合理选择。同时，ATP定量检测作为细胞活力评估的一种方法，也被证明是实用且灵敏的，尽管其他代谢和膜完整性检测方法可能在解释结果时提供更全面的信息。

此外，我们还对实验材料和抗体的生产与纯化过程进行了详细描述。实验中使用的材料包括Amersham? ECL? Prime Western blotting试剂、预制的丙烯酰胺凝胶、运行和转移缓冲液等，这些材料均来自GE Healthcare Life Sciences和GeneScript公司。用于实验的试剂还包括Zeocin、Puromycin和人源TNF-α，这些试剂由MedChemExpress公司提供。Phospha-Light? SEAP报告基因检测系统、人源TNF-α单克隆抗体（目录号MA5-23720）、抗牛HRP标记抗体（目录号15261648）、Immobilon?-P PVDF转移膜以及Tube-O-Dialyzer等实验用品也用于本研究。抗体的生产与纯化过程中，我们发现杂交瘤细胞的生长和抗体分泌高度依赖于胎牛血清（FBS）的存在。去除FBS后，即使在RPMI培养基中添加了完整的氨基酸混合物，细胞的活力仍显著下降，抗体分泌也完全停止。此外，使用专门设计用于增强氧合的锥形烧瓶对细胞活力产生了负面影响，表明培养条件对实验结果具有重要影响。

本研究的结果表明，L929细胞检测法和HEK293 Blue细胞检测法在评估抗TNF-α抗体的中和能力方面均具有显著价值。HEK293 Blue细胞检测法因其快速、高灵敏度和良好的可重复性，特别适用于高通量筛选。然而，L929细胞检测法在揭示TNF-α信号在生理条件下的后期效应方面具有独特的优势，如细胞凋亡和代谢紊乱。因此，采用这两种检测方法的组合，可以更全面地评估抗TNF-α抗体的功能特性，确保其在不同条件下的表现得到充分理解。

在实验设计和方法优化方面，我们采用了多种策略以提高检测的准确性和可靠性。首先，我们对实验条件进行了细致的优化，包括培养基的成分、细胞的生长状态以及检测时间点的选择。其次，我们对实验数据进行了统计分析，以确保结果的稳健性和可重复性。最后，我们对实验流程进行了改进，以减少实验误差并提高工作效率。这些优化措施不仅提高了实验的准确性，还为未来类似研究提供了可借鉴的方案。

本研究的结论强调了在评估抗TNF-α抗体功能时，采用多种检测方法的重要性。HEK293 Blue细胞检测法和L929细胞检测法各自具有独特的优势，能够提供互补的信息。因此，结合这两种检测方法可以更全面地了解抗体的功能特性，确保其在不同条件下的表现得到充分评估。这种双检测方法的策略不仅适用于抗TNF-α抗体的研究，也可以推广到其他治疗性抗体的评估中，以提高研究的全面性和可靠性。

在实验过程中，我们还注意到一些潜在的问题和挑战。例如，不同细胞系对TNF-α的响应可能存在差异，这可能会影响实验结果的可比性。此外，某些细胞系可能对特定的抗体表现出更高的敏感性，而另一些细胞系则可能对同一抗体的响应较弱。因此，在选择细胞系时，需要根据研究目的和抗体特性进行综合考虑。同时，实验条件的优化也是确保结果准确性的关键因素。例如，培养基的成分、细胞的生长状态以及检测时间点的选择都需要仔细调整，以避免实验误差和结果偏差。

为了确保实验的可重复性和结果的可靠性，我们还对实验数据进行了详细的记录和分析。通过多次重复实验，我们验证了检测方法的稳定性和一致性。此外，我们还对不同实验条件下的结果进行了比较，以确定最佳的实验方案。这些措施不仅提高了实验的科学性和严谨性，还为未来的研究提供了坚实的基础。

在研究过程中，我们还发现了一些有趣的现象。例如，某些抗TNF-α抗体在HEK293 Blue细胞检测中表现出较高的中和能力，但在L929细胞检测中则显示出较低的中和效果。这种差异可能与不同细胞系对TNF-α信号通路的响应机制有关。因此，在评估抗体功能时，需要结合多种检测方法，以全面了解其在不同条件下的表现。这种综合评估方法能够更准确地反映抗体的真实功效，为临床应用和进一步研究提供有力支持。

本研究的成果不仅对抗TNF-α抗体的开发具有重要意义，也为其他治疗性抗体的研究提供了借鉴。通过系统比较不同检测方法的优缺点，我们为未来的抗体评估研究提供了新的思路和方法。同时，我们还强调了在抗体开发过程中，实验条件和检测方法选择的重要性，以确保研究结果的准确性和可靠性。

总之，本研究通过系统评估抗TNF-α抗体在两种不同检测平台上的表现，揭示了它们在中和能力、信号可重复性和检测灵敏度方面的差异。这些发现不仅为抗TNF-α抗体的功能评估提供了新的视角，也为未来的抗体开发和研究奠定了坚实的基础。通过结合多种检测方法，研究人员可以更全面地了解抗体的功能特性，确保其在不同条件下的表现得到充分评估。这种综合评估方法对于提高抗体的治疗效果和研究的科学性具有重要意义。