通过DNA甲基化分析和转录组测序揭示珍珠贝（Pinctada fucata martensii）在缺氧预处理下的分子机制

《Aquaculture》：Molecular mechanisms of hypoxic preconditioning in the pearl oyster Pinctada fucata martensii revealed by DNA methylation profiling and transcriptome sequencing

珍珠贝低氧预适应（HPD）提升耐缺氧能力研究：通过8次2.0 mg/L低氧暴露及48小时恢复，HPD组珍珠贝在15天缺氧胁迫下存活率提高36.96%，抗氧化酶活性增强，MDA水平降低。转录组分析显示1253个差异表达基因富集于谷胱甘肽代谢（23.5%）、脂代谢（18.9%）及血清素突触（15.7%）等通路，DNA甲基化分析鉴定出21,430个CG型差异甲基化区域（DMRs），其关联基因在MAPK信号通路（12.3%）、内质网蛋白加工（10.1%）等55条KEGG通路显著富集。研究揭示HPD通过强化抗氧化防御、重构能量代谢、调控凋亡及神经保护机制提升珍珠贝抗缺氧韧性，为养殖中环境胁迫应对提供理论支撑。

本研究聚焦于珍珠贝 *Pinctada fucata martensii* 在低氧环境下的耐受性提升，探讨了低氧预处理（HPD）对其生理与分子机制的影响。珍珠贝作为一种重要的经济贝类，广泛养殖于中国南方、日本、澳大利亚、印度及东南亚地区，其养殖模式通常依赖于近岸的筏式和堆式系统。然而，这些系统往往使珍珠贝暴露于多变的环境压力，包括溶解氧（DO）波动、温度变化、盐度差异以及污染问题。此外，养殖环境中的生物附着现象也显著影响水体交换效率，进一步加剧了低氧压力。随着全球气候变化和人类活动的增加，低氧现象在沿海生态系统中愈发普遍，尤其在如中国最大的海洋珍珠养殖区——流沙湾，低氧状况在每年7月至9月期间尤为显著，导致珍珠贝夏季死亡率升高，因此提升其低氧耐受能力对优化珍珠产量具有重要意义。

近年来，关于贝类低氧耐受性的研究逐渐深入，科学家们希望通过揭示其适应机制来提高养殖效率。例如，在弧形贝类中，低氧耐受性与厌氧代谢过程中天冬氨酸的消耗减少密切相关。此外，不同种群的珍珠贝在低氧耐受性方面也表现出遗传差异，这可能与特定种群中压力响应通路的基因提前激活有关。在太平洋牡蛎中，低氧耐受性具有遗传性，且不受生长速率影响，这表明其是选择性育种的重要目标。目前，改善水生生物低氧耐受性的研究主要集中在杂交育种和营养干预方面。然而，环境压力也能诱导适应性反应，这些反应涉及多种行为、生理、生化和分子层面的变化。例如，适度的运动已被证明有助于调节压力反应并促进神经可塑性，而压力预测训练则能帮助鱼类提前适应环境变化，从而增强其应激应对能力。因此，低氧预处理作为一种方法，通过让生物暴露于非致死性的低氧环境以激活细胞防御系统，已被认为是一种有效的手段。

本研究采用多组学技术，结合转录组测序和DNA甲基化分析，系统评估了HPD对珍珠贝 *P. f. martensii* 在低氧压力下的生理与生化特性的影响。DNA甲基化作为一种表观遗传调控机制，在水生生物的应激反应中扮演着重要角色。例如，在太平洋牡蛎中，DNA甲基化可能调节其对温度变化的适应性，而在日本比目鱼中，急性低氧可通过对低氧诱导因子-1/血管内皮生长因子信号通路的调控，引起鳃的形态变化。近年来，科学家们将DNA甲基化与转录组分析相结合，以深入研究不同水生生物的应激反应。这一方法为揭示珍珠贝在低氧环境下的适应机制提供了新的视角。

在实验设计方面，本研究选择了健康的珍珠贝（年龄为1.5年），并排除了受到生物附着影响的个体。随后，这些珍珠贝在正常氧条件下（DO为7.0 mg/L）适应了14天。接下来，珍珠贝被置于低氧环境（DO为2.0 mg/L）中进行24小时的处理，之后转移到正常氧环境中进行48小时的恢复期。这一处理流程参考了之前的研究方法，旨在模拟低氧预处理对珍珠贝的影响。通过这一处理，研究人员观察到珍珠贝在低氧压力下的生存率显著提高，同时其鳃的凋亡现象也有所缓解。在生存率方面，经过15天的低氧压力，HPD组的珍珠贝生存率比对照组高出36.96%。此外，在低氧处理初期（第0天），HPD组中TUNEL阳性细胞的比例显著高于对照组，表明低氧预处理可能在早期阶段就激活了细胞凋亡相关的防御机制。

低氧预处理对珍珠贝的抗氧化能力也有显著提升作用。低氧环境会迅速抑制贝类的线粒体呼吸作用，进而破坏氧化剂与抗氧化剂之间的平衡，导致由过量活性氧引起的氧化应激，这种应激会损害细胞膜、蛋白质和DNA。在低氧条件下，珍珠贝的抗氧化系统尤为重要，因为它能够防止氧化损伤的积累。实验结果显示，HPD组的珍珠贝在低氧压力下表现出更强的抗氧化酶活性，这表明其能够更有效地清除活性氧，从而减少氧化应激对细胞的损害。此外，HPD组的珍珠贝在消化酶和能量代谢相关酶的活性方面也有所增强，而丙二醛（MDA）水平则显著降低，MDA是衡量脂质过氧化的重要指标，其水平降低意味着细胞膜受损程度减轻。

通过转录组测序，研究人员鉴定了1253个差异表达基因（DEGs），这些基因在谷胱甘肽代谢、脂质代谢和血清素能突触等通路中显著富集。这些通路的富集表明，HPD可能通过调节这些关键代谢过程来增强珍珠贝的低氧耐受能力。例如，谷胱甘肽代谢通路与抗氧化防御密切相关，而脂质代谢则可能在能量供应方面起到重要作用。血清素能突触通路的富集则提示，HPD可能对珍珠贝的神经功能调节具有影响，从而增强其在低氧环境下的适应能力。

DNA甲基化分析进一步揭示了HPD对珍珠贝基因表达的调控作用。研究发现，在HPD组和对照组之间存在21,430个CG型差异甲基化区域（DMRs）。这些DMRs与55个KEGG通路显著相关，包括MAPK信号通路、内质网中蛋白质加工通路以及糖酵解/糖异生通路。这些通路的富集表明，HPD可能通过调控DNA甲基化来影响珍珠贝的细胞信号传导、蛋白质合成以及能量代谢过程。此外，研究还发现，217个同时存在于CG型DMRs和DEGs中的基因在色氨酸代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生通路以及突触小泡循环等过程中显著富集。这些基因的共同调控可能表明，HPD通过整合表观遗传和转录调控机制，增强了珍珠贝的低氧耐受能力。

综合来看，低氧预处理对珍珠贝的低氧耐受性提升作用可能体现在多个层面。首先，它通过增强抗氧化防御系统，减少氧化应激对细胞的损害。其次，它可能通过改变能量代谢方式，从依赖糖酵解转向利用脂质和氨基酸，从而提高能量供应效率。此外，低氧预处理可能通过调控凋亡相关通路，减少细胞死亡的发生。同时，它还可能通过维持神经功能，提高珍珠贝在低氧环境下的适应能力。这些机制的共同作用，使得珍珠贝在低氧压力下表现出更强的生存能力和生理适应性。

本研究的发现为珍珠贝的低氧耐受性提供了新的理论支持，同时也为水产养殖中低氧耐受性相关基因的筛选和管理提供了依据。通过深入理解低氧预处理对珍珠贝的影响机制，未来可以进一步优化其养殖策略，提高珍珠贝在低氧环境下的存活率，从而减少因低氧导致的养殖损失。此外，这些研究结果也对其他水生生物的低氧耐受性研究具有参考价值，为开发新的应激应对策略提供了科学依据。随着多组学技术的发展，科学家们能够更全面地分析生物在应激环境下的反应，为提高水生生物的适应能力和生存能力提供了新的工具和方法。