具有细胞穿透肽功能的仿生纳米囊泡，通过增强角膜渗透性和同时靶向晶状体与线粒体，实现高效的白内障治疗

《Bioactive Materials》：Cell-penetrating peptide-functionalized biomimetic nanovesicles for efficient cataract treatment via enhanced corneal penetration and lens-mitochondria dual targeting

白内障是由晶状体氧化应激失衡引发的常见致盲眼病，现有治疗方法存在侵入性风险。本研究设计了一种基于“载体-负载载体”策略的仿生纳米递送系统LSPE@Cur，通过曲曲梅素（Cur）调控Nrf2信号通路增强抗氧化酶表达，结合细胞穿透肽（PENE）的线粒体靶向性和膜融合技术实现精准递送。实验证实该系统可有效穿透角膜屏障，靶向晶状体上皮细胞并稳定线粒体膜电位，在体外和动物模型中均显著抑制氧化应激并改善晶状体透明度。

　　白内障是全球导致失明的主要原因之一，其核心特征是晶状体的混浊，这种混浊会显著影响视力并严重降低患者的生活质量。目前，唯一有效的治疗方法是超声乳化吸除术结合人工晶状体植入，尽管手术效果显著，但其侵入性以及可能引发的术后并发症，如后囊膜混浊、眼内压升高和眼内炎，表明亟需非侵入性、安全且高效的预防性策略。研究表明，晶状体中氧化应激平衡的破坏在白内障的形成和进展中起着关键作用。紫外线辐射和内源性代谢过程会持续产生活性氧（ROS），如超氧阴离子（•O??）、羟基自由基（•OH）和过氧化氢（H?O?），这些物质会导致晶状体蛋白的不可逆损伤。因此，维持晶状体的氧化应激平衡是预防白内障的关键策略。

为了应对这一挑战，研究人员设计了一种多功能纳米递送系统LSPE@Cur，该系统基于细胞穿透肽（PENE）功能化的生物模拟膜杂交技术，旨在通过协同调节线粒体稳态和氧化应激平衡来预防白内障。LSPE@Cur的构建结合了姜黄素（Cur）脂质封装技术和PENE功能化，随后通过外泌体膜融合，形成了具有长角膜表面滞留能力和深层穿透能力的生物模拟纳米载体。该系统通过外泌体整合素和跨膜转运蛋白实现了同源靶向，而PENE的多阳离子结构确保了精确的线粒体递送，从而建立了“组织-细胞器”双重靶向策略。姜黄素能够激活Nrf2信号通路，上调细胞内源性抗氧化酶的表达，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx），从而增强细胞抗氧化能力并保护免受氧化损伤。这一机制使得姜黄素成为长期、高效预防白内障的有希望候选药物。然而，其临床转化受到水溶性差、生物利用度低以及缺乏针对晶状体的特定靶向策略的限制，因此，实现姜黄素的高效递送并达到晶状体的有效药物积累是充分发挥其预防潜力的关键挑战。

随着纳米技术的不断发展，姜黄素的药物递送效率得到了显著提升。各种纳米载体已被证明能够有效提高姜黄素的生物利用度。外泌体因其出色的生物相容性和整合素介导的归巢靶向能力，成为理想的晶状体药物递送载体。外泌体膜表面富含同源细胞的跨膜蛋白和磷脂域，使其能够高效识别并结合晶状体上皮细胞。然而，外泌体载体的临床转化仍面临可扩展生产、成本高昂以及药物负载效率不足等挑战。受“药物负载药物”系统的协同效应启发，本研究提出了一种创新的“载体负载载体”系统，结合了脂质体和外泌体的优势。通过利用脂质体的高封装效率和成熟的制备工艺，并结合外泌体的靶向功能域，研究人员旨在开发一种兼具高效药物负载和精准递送能力的生物模拟纳米囊泡。该系统旨在作为眼药水配方，用于姜黄素的靶向递送。

值得注意的是，由于多层眼部屏障，如角膜上皮紧密连接和泪液清除，眼药水制剂常常面临低眼部渗透性的挑战。纳米载体可以有效增强药物稳定性，但还需要进一步的功能性修饰以提高药物渗透效率。研究表明，阳离子修饰策略，如壳聚糖和细胞穿透肽（CPPs），可以通过吸附到角膜黏液层并暂时打开上皮紧密连接，从而增强药物在眼部的滞留和渗透。CPPs因其低免疫原性、高渗透效率和独特的功能域，在研究中受到广泛关注。特别是PENE肽（序列：RQIKIWFQNRRMKWKK），在多项研究中已被证明具有出色的细胞穿透能力。更值得注意的是，PENE肽包含线粒体前蛋白加工（MPP）酶切割位点（RR）和富含精氨酸/赖氨酸的区域，这赋予了其线粒体靶向的潜力。当与纳米囊泡的两亲性结构结合时，PENE肽为姜黄素的精准递送提供了前景，从而在源头减少氧化应激损伤，维持线粒体功能和氧化应激稳态，并保护晶状体上皮细胞。

本研究开发了一种基于PENE功能化的脂质体-外泌体杂交生物模拟纳米囊泡（LSPE@Cur），旨在通过姜黄素的抗氧化作用，实现对晶状体氧化应激稳态的重塑，从而预防白内障的发生和发展。具体而言，使用薄膜水化法制备了负载姜黄素的脂质体（LS@Cur），随后通过酰胺偶联法将PENE修饰到囊泡表面，得到LSP@Cur。最后，通过膜融合技术将外泌体与LSP@Cur结合，形成LSPE@Cur。物理化学表征结果显示，LSPE@Cur和LS@Cur均表现出良好的水溶性，并显示出姜黄素的特征紫外吸收峰（421 nm），证实了姜黄素在纳米载体中的稳定封装。傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析进一步揭示了PENE修饰的特征：3200–3600 cm?1范围内的宽峰对应于N-H伸缩振动，1750 cm?1处的尖锐峰归因于羧基和酰胺基团的C=O伸缩振动，而1350 cm?1处的特征峰反映了PENE中CH?的对称弯曲振动。系统的光谱位移确认了PENE的成功锚定。纳米颗粒追踪分析（NTA）量化结果显示，原始外泌体的粒子浓度为2.9×101?颗粒/mL，而LSP@Cur和LSPE@Cur的粒子浓度达到了2.2×1011颗粒/mL。在荧光模式下，Dio标记的外泌体维持了2.7×101?颗粒/mL的信号，而未标记的LSP@Cur则未检测到显著信号。LSPE@Cur由于膜融合，表现出1.8×1011颗粒/mL的荧光正粒子，显著高于自由外泌体的信号，进一步确认了外泌体膜蛋白在LSP@Cur表面的整合成功。此外，Zeta电位分析揭示了显著的界面电化学重组：LS@Cur的表面电位为-7.8±0.35 mV。在PENE修饰后，LSP@Cur的电位显著向正方向变化至-2.0±0.3 mV（Δζ=+5.8 mV，p<0.001），这归因于PENE分子链中氨基基团的正电荷贡献。与LSE@Cur相比，LSPE@Cur也表现出类似的电位增加。LSP@Cur和LSPE@Cur之间2.8 mV的电位差异（p<0.04）进一步证实了外泌体膜蛋白整合导致的表面电荷重新分布。

表面形态分析显示，所有五种纳米囊泡的扫描电子显微镜（SEM）图像（图1F）均呈现出典型的球形结构，并具有良好的分散性。透射电子显微镜（TEM）负染色（图1G）表明所有颗粒均显示出磷脂双分子层的典型超微结构。干燥后的外泌体粒径约为50 nm，而其他四种纳米囊泡的粒径约为100 nm。动态光散射（DLS）分析显示，外泌体的水动力直径主要集中在100 nm左右，而其他四种纳米囊泡的粒径分布更宽，范围在100–300 nm之间。四类纳米载体系统的稳定性通过DLS在14天内持续监测。值得注意的是，外泌体在第4天表现出显著的电位和粒径波动，而其他三种系统在整个观察期内保持相对稳定。特别是LSPE@Cur即使在整合外泌体碎片后，也未表现出类似的不稳定性。这种增强的稳定性很可能归因于脂质体出色的结构完整性，有效锚定外泌体成分在纳米载体表面。

抗氧化活性评估（图1H和I）显示，姜黄素及其纳米药物制剂的ABTS自由基清除能力达到Trolox的2.5倍，证实了纳米封装过程未引起姜黄素活性酚羟基的构象变化。DPPH动力学分析进一步表明，LSPE@Cur干预后，517 nm处的特征吸收峰在6分钟内迅速下降，并在30分钟内持续减弱，伴随颜色从紫色变为浅黄色，从而确认了LSPE@Cur对姜黄素抗氧化活性的有效保留。如图1J–L所示，QCM-D界面结合分析显示，PENE修饰的LSP@Cur和LSPE@Cur在黏蛋白功能化的金芯片上引入后，出现了显著的负频率偏移。这表明纳米囊泡在与黏蛋白结合后聚集在金芯片表面，显示出强黏蛋白结合能力。相比之下，LS@Cur和LSE@Cur的引入导致黏蛋白被洗去。进一步的纳米囊泡与黏蛋白共培养实验显示，经过1小时培养后，LSP@Cur和LSPE@Cur系统均表现出浑浊和相分离现象，这归因于纳米囊泡在与黏蛋白结合后水溶性的变化。同时，Zeta电位分析显示，LSP@Cur和LSPE@Cur的表面电位出现了显著的负移，证实了纳米囊泡通过氢键和静电相互作用与黏蛋白结合。此外，五种纳米载体系统和HLECs的Western blot分析显示，Mac在HLECs中无法检测到，而CD9条带在Exosomes、LSE@Cur和LSPE@Cur中则极其微弱。相反，Exosomes、LSE@Cur和LSPE@Cur中Mac和CD9的高表达，证实了外泌体的分离和其在递送系统中的有效整合。Western blot定量分析（图1M和N）显示，LSE@Cur和LSPE@Cur中CD9、CD63和Alix的保留率约为80%，这证实了生物模拟纳米囊泡表面整合了整合素配体和跨膜转运蛋白，为药物递送系统提供了更可靠的靶向基础。

为了进一步评估LSPE@Cur在体外对角膜渗透性的影响，本研究构建了HCECs的单层模型，并与LS@Cur、LSP@Cur、LSE@Cur和LSPE@Cur进行共培养。如图2A和B所示，动态观察HCECs的紧密连接结构在0–4小时内发生了变化。Exo、LS@Cur和LSE@Cur处理的HCECs以及未处理的HCECs均显示出紧密连接形成的趋势。然而，当与带有细胞穿透肽（PENE）的纳米颗粒共培养时，HCECs的紧密连接被破坏。基于PENE的时空可逆调控特性，本研究采用了HCECs单层模型，与LS@Cur、LSP@Cur、LSE@Cur和LSPE@Cur进行共培养。如图2C所示，经过2小时处理后，PENE修饰组（LSP@Cur/LSPE@Cur）中ZO-1蛋白荧光的连续性被破坏，β-微管蛋白的边缘变得模糊，证实了纳米载体有效打开了紧密连接。时间进程分析（图2D）显示，经过4小时处理后，ZO-1重新排列形成新的环状结构，同时微管网络发生重组，揭示了连接结构的动态和可逆性。F-肌动蛋白免疫荧光追踪（图2E）进一步表明，在LSP@Cur和LSPE@Cur处理组中，细胞间荧光带变窄，应力纤维解聚，并伴随点状结构，表明细胞骨架重组和细胞侧向收缩，从而导致细胞间间隙的开放。这说明PENE修饰的纳米载体系统通过跨膜转运的协同机制增强了药物递送。值得注意的是，如图2F所示，Western blot定量分析显示，经过4小时共培养后，Smad2/3水平显著下调，而ZO-1表达增加，表明TGF-β/Smad信号轴与紧密连接稳态之间存在动态调控网络。在HCECs/HLECs双层的体外角膜模型中，LSP@Cur和LSPE@Cur组的角膜渗透效率达到150%（相比LS@Cur和LSE@Cur组）（图2G–I）。PENE修饰可能通过其阳离子域介导紧密连接的暂时可逆打开，协调内吞作用，实现协同转运。

为了进一步研究LSPE@Cur的体外选择性细胞靶向、摄取和细胞内运输特性，本研究采用了荧光标记的姜黄素（C6）和不同纳米载体系统进行实验。如图3A所示，进入HLECs后，自由C6主要被包裹在吞噬小泡中，并在4小时后出现显著的细胞膜积累和广泛的溶酶体共定位。相比之下，LS@C6和LSPE@C6实现了显著的细胞内释放，从而促进更高效的细胞内药物递送（图3B）。如图3C所示，LSPE@Cur在HLECs中表现出显著的线粒体靶向能力，其荧光信号与线粒体信号高度重叠。相比之下，C6和LS@C6组的药物信号与线粒体信号没有重叠，甚至出现反向趋势。值得注意的是，LSPE@Cur处理组中HLECs的线粒体膜标记物TOMM20表达显著上调，这进一步支持了LSPE@Cur的线粒体靶向能力（图3E和F）。IDT显微镜图像（图3G）进一步验证了这一结果，显示LSPE@Cur处理组中C6与线粒体显著共定位，而LS@Cur处理组中C6则主要局限于细胞膜。

在体内生物相容性评估方面，本研究系统地评估了LS@Cur、LSP@Cur、LSE@Cur和LSPE@Cur对眼部组织的影响。通过裂隙灯显微镜动态监测（术后第1–9天）显示，药物处理组大鼠的眼部表面结构保持完整，具有高透明度和强红光反射（图6A和图S7A），证实了材料的出色光学相容性。角膜OCT成像分析（图6B和图S7B）显示，经过9天连续处理后，实验组的角膜三维结构保持完整，中心厚度与健康对照组无显著差异。为了评估纳米颗粒穿透的安全性，研究人员评估了眼球后段的神经生理活动。暗适应的0.01/3.0 ERG测试显示，药物处理组大鼠的视杆和视锥细胞功能在正常波动范围内（图6C）。在光适应条件下，3.0 Ficker 30 Hz ERG记录显示出稳定的正弦波形，进一步确认了纳米载体对视锥细胞信号传导通路无影响。此外，视网膜结构分析（图6D、E和图S7C、D）显示，经过9天干预后，实验组的视网膜分层结构保持完整，黄斑区维持其生理形态。组织连续性和厚度分布与对照组一致。OCTA灌注评估证实，表层毛细血管丛密度正常，深层毛细血管灌注均匀，黄斑无血管区具有清晰边界，周边血管模式遵循生理弯曲。多模态晶状体显微镜（顶光/底光/组合模式）显示，两种制剂的长期使用并未改变晶状体的形态参数或光学特性（图6F）。组织病理学评估（图6G）进一步证实，药物处理组的角膜、虹膜和视网膜组织结构完整，H&E染色未观察到炎症浸润或病理变化。这些结果表明，LS@Cur和LSPE@Cur在眼部组织中表现出全面的相容性，维持了后段微循环的稳态和光学透明度，凸显了LSPE@Cur作为晶状体靶向眼药水配方的临床潜力。

为了进一步评估LSPE@Cur在晶状体中的渗透性和靶向递送效率，研究人员使用荧光标记的姜黄素（C6）和不同纳米载体系统进行实验。如图7A所示，LS@Floures由于其磷脂双分子层结构，表现出良好的角膜亲和力，单次滴眼后2分钟即可在结膜囊中检测到药物保留。相比之下，LSPE@Floures通过增强黏蛋白结合，保持了显著更高的角膜表面保留，这一现象通过OCT成像确认。体内药代动力学分析（图7B和C）显示，自由Dir组的荧光强度在前10分钟内减少了83%，而LS@Dir和LSPE@Dir组分别减少了61%和49%。30分钟后，LSPE@Dir保留了其相对荧光强度的40%，显著优于自由药物组。角膜组织荧光成像（图7D）进一步证实了LS@C6和LSPE@C6对角膜屏障的有效穿透，而晶状体荧光分析（图7E和F）显示，LSPE@C6能够穿透晶状体囊膜，实现深层药物递送，其在晶状体核心区域的荧光强度是LS@C6的两倍以上。值得注意的是，LSPE@C6处理组在整个晶状体中表现出特征性的绿色荧光，而LS@C6处理组仅在晶状体外层显示荧光，证实了LSPE@C6在晶状体中的优异渗透性和靶向能力。角膜渗透机制研究（图7G–I）显示，LSPE@Cur处理组的上皮钙粘蛋白免疫组化信号显著低于健康组。GSEA分析显示，该基因集在眼部组织中显著富集，表明LSPE@Cur通过调控角膜细胞连接来增强药物渗透。此外，ZO-1免疫荧光显示，LSPE@Cur处理组的角膜上皮细胞边界出现胞浆扩散，与健康组的完整细胞边界形成对比，证实了LSPE@Cur能够暂时、可逆地调节角膜上皮屏障功能。这些发现系统地阐明了LSPE@Cur的三重递送优势：良好的角膜保留、可控的屏障穿透和精准的晶状体靶向，为新型眼表药物递送系统的开发提供了机制基础。

为了评估LSPE@Cur在白内障预防中的作用，本研究比较了不同的治疗策略，并测量了光学透明度、晶状体囊膜厚度、晶状体透明度和抗氧化酶表达。UVB诱导的白内障模型的疗效评估（图8A和图S8A）显示，PBS组在第5天出现显著的光透射率下降，第7天观察到轻度晶状体混浊，第9天完全混浊。而LS@Cur干预延缓了白内障的发展，但在第7天后仍出现透明度的逐步下降。相比之下，LSP@Cur和LSE@Cur处理组的玻璃体内透射率比LS@Cur组有所改善，但其透明度仍不如LSPE@Cur处理组。LSPE@Cur处理组在整个研究期间保持正常的光透射率。OCT成像分析（图8B和图S8C）证实，PBS组表现出典型的皮质白内障特征（前囊膜边界模糊），而LS@Cur、LSP@Cur、LSE@Cur和LSPE@Cur处理组均保持晶状体透明度。多角度光学评估（顶光/底光模式）进一步显示，PBS组出现显著的晶状体混浊，而LS@Cur、LSP@Cur、LSE@Cur和LSPE@Cur处理组的晶状体透明度与健康组相当（图8C和图S8B）。晶状体透射率分析显示，UVB暴露使晶状体透射率降至未处理对照组的约87%。相比之下，使用LS@Cur和LSPE@Cur处理后，晶状体透射率显著提高，主要维持在95%以上。值得注意的是，LSPE@Cur处理几乎完全防止了UVB引起的晶状体透射率下降（图S9A和B）。基于LOCS III分级系统的定性评估显示，UVB诱导组大鼠的平均白内障等级接近3级，而LS@Cur处理组保持在1级以下，LSPE@Cur处理组的平均等级甚至更低，通常低于1级（图S9C）。晶状体组织的免疫组化分析表明，UVB暴露显著激活了内源性CAT酶活性。重要的是，LS@Cur和LSPE@Cur处理组的晶状体切片显示出更强烈的CAT免疫反应性。这些表型结果表明，这两种纳米载体制剂能够有效增强晶状体抗氧化酶系统的生物功能。与这些发现一致，晶状体SOD表达的免疫荧光分析（图8E）显示，LS@Cur和LSPE@Cur处理组的SOD表达显著上调。这些结果表明，该纳米药物递送系统在精准调控关键抗氧化酶通路以缓解氧化应激介导的白内障发展中具有巨大潜力。如图8F所示，KEGG通路富集分析显示，LSPE@Cur+UVB组的眼组织中氧化磷酸化通路的激活显著高于PBS+UVB组。Reactome分析显示，LSPE@Cur+UVB组与PBS+UVB组眼组织中差异表达蛋白与氧化应激相关通路的关联性更高。此外，氧化应激相关蛋白的GO富集分析显示，LSPE@Cur处理组的眼组织中抗氧化酶的表达显著高于PBS处理组。此外，LSPE@Cur与PBS组差异表达蛋白的GO富集分析显示，线粒体膜蛋白和氧化还原酶的表达显著上调，表明LSPE@Cur可能在眼组织中表现出有效的线粒体靶向性，并通过增强氧化还原酶的表达保护细胞免受氧化应激的影响。

总之，本研究成功开发了一种基于细胞穿透肽功能化的脂质体-外泌体杂交生物模拟纳米药物递送系统LSPE@Cur，通过整合黏蛋白亲和力PENE和两亲性纳米载体，实现了协同的“角膜黏附-屏障穿透”效应。外泌体膜上的丰富整合素蛋白和跨膜转运蛋白为药物递送系统提供了可靠的同源靶向能力。PENE肽的独特氨基酸序列，包括线粒体前蛋白加工（MPP）酶切割位点和高密度的阳离子精氨酸/赖氨酸残基，赋予了该系统时空可控的线粒体靶向能力。更重要的是，姜黄素通过有效激活Nrf2信号通路，上调晶状体上皮细胞内源性抗氧化酶的表达，从而增强了其对氧化应激的内在抵抗力，并有助于建立稳定、持久且高效的抗氧化防御系统。该系统展示了显著的精准药物递送潜力，减少了给药频率，并提供了白内障的长期预防。体外和体内实验均表明，LSPE@Cur表现出良好的生物相容性，并克服了传统眼药水如较差的眼部滞留能力和较低的晶状体药物积累的局限性。在细胞内，它提供了理想的线粒体靶向能力。通过激活Nrf2信号通路、增强抗氧化酶表达、清除ROS和维持线粒体稳态，LSPE@Cur为晶状体上皮细胞提供了全面的保护，使其免受氧化应激的影响。此外，“结构模拟-功能协同-机制互补”的设计策略为眼部组织靶向递送系统的发展引入了新的范式，展现出重要的转化医学和临床前研究价值。尽管皮质白内障是最常见的临床类型，通常被认为是紫外线辐射和内源性代谢因素引起的晶状体氧化应激稳态失衡所致，但大量研究表明，与年龄相关的核性白内障主要由慢性衰老过程中释放的衰老相关因子触发，而非单纯的氧化应激。在本研究中，LSPE@Cur仅在UVB诱导的氧化应激性皮质白内障大鼠模型中表现出有希望的保护效果。然而，其在灵长类模型中的功效尚未评估，且尚未在由其他因素（如与衰老相关的核性白内障）引起的白内障中进行研究。