PROTAC介导的CD26结构-功能紊乱：一种针对驱动基因阴性的非小细胞肺癌的治疗策略

《Drug Resistance Updates》：PROTAC-mediated structure–function disruption of CD26: a therapeutic strategy for driver-negative non-small cell lung cancer

靶向CD26的蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）P4-3在驱动基因阴性非小细胞肺癌（NSCLC）中展现出高效且选择性好的抗肿瘤活性。通过表面等离子共振（SPR）和纳米BRET技术证实P4-3与CD26结合能力强，形成稳定三元复合物并诱导CD26内吞及蛋白酶体降解。机制研究表明，CD26降解导致膜结合腺苷脱氨酶（ADA）转位至胞质，引发胞内腺苷耗竭、线粒体ROS积累、代谢紊乱和DNA损伤，激活ROS介导的凋亡通路。P4-3在细胞系、CDX模型、原位肺癌模型及患者来源类器官中均显示显著抑癌效果，且对正常支气管上皮细胞毒性极低。生物安全性评估显示其无胰腺炎等显著毒性。本研究为驱动基因阴性NSCLC提供了新型治疗策略，并揭示PROTACs靶向膜蛋白的多效性降解机制。

在肺癌治疗领域，非小细胞肺癌（NSCLC）是主要的挑战之一，因其高发病率和高死亡率而备受关注。传统的分子靶向治疗策略主要依赖于针对驱动基因突变（如EGFR/ALK）的靶向药物，但大约30%至40%的NSCLC患者因缺乏可靶向的突变而无法获得有效的治疗方案。因此，对于这些患者而言，开发新的治疗策略显得尤为迫切。针对这一问题，研究团队提出了一种创新性的治疗手段——靶向CD26的蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）技术。CD26（也称为DPP4）是一种在超过85%的NSCLC病例中过表达的跨膜糖蛋白，它不仅作为诊断标志物，也展现出作为治疗靶点的潜力。然而，传统的针对CD26酶活性的小分子抑制剂在临床应用中效果有限，可能是因为它们未能有效干扰CD26的非酶活性功能及其与膜结合腺苷脱氨酶（ADA）等分子的相互作用。

PROTACs作为一种新兴的治疗策略，通过催化降解特定的疾病相关蛋白，提供了不同于传统抑制剂的治疗方式。其机制基于“事件驱动”的蛋白降解原理，能够有效降低药物耐受性，提高选择性，减少所需剂量，并扩展对非酶活性致癌蛋白（如转录因子和膜蛋白）的靶向能力。尽管此前已有针对EGFR、ALK等激酶的PROTACs研究，但CD26作为靶点的PROTACs在缺乏驱动突变的NSCLC中的治疗潜力尚未得到充分验证。因此，研究团队设计并合成了针对CD26的PROTACs，包括P4-1至P4-4，其中P4-3表现出最优的降解效果。

研究通过多种实验手段验证了P4-3的治疗效果。首先，使用表面等离子体共振（SPR）技术评估了P4-3与CD26的结合强度，结果显示P4-3具有较强的亲和力。随后，通过NanoBRET?活细胞三元复合物分析确认了P4-3能够与CD26和E3连接酶CRBN形成稳定的三元复合物。实验进一步利用CD26阴性NSCLC细胞系（NCI-H460和NCI-H1299）及BEAS-2B正常细胞进行体外降解性能研究，发现P4-3在低浓度下（约500 nM）对CD26具有显著的降解能力，同时对其他同源酶（如DPP7、DPP8、DPP9）和FAP的影响较小，表明其具有良好的选择性。此外，通过细胞来源异种移植（CDX）、体内肺部肿瘤模型及患者来源类器官（PDOs）进一步评估了P4-3的体内治疗效果，发现其在体内和体外均能有效抑制肿瘤生长。

从机制上讲，P4-3诱导的CD26降解不仅消除了其酶活性，还去除了其关键的非酶活性功能，这种双重效应是传统抑制剂难以实现的。具体而言，CD26与膜结合ADA的相互作用被破坏，导致ADA从膜上转移到细胞质，从而引起细胞内腺苷水平的下降。这种腺苷耗竭现象进一步导致线粒体中活性氧（ROS）的积累，引发代谢应激和DNA损伤，最终激活内在的细胞凋亡途径。实验结果显示，P4-3在多种细胞系和体内模型中均能显著诱导凋亡，而对正常细胞几乎没有毒性，这表明其具有良好的生物安全性。

在体内研究中，研究团队还对P4-3的生物安全性进行了系统评估。使用健康的C57BL/6小鼠进行实验，结果显示P4-3不会引起主要器官的损伤，同时对血清中的生化指标（如ALT、CREA和α-淀粉酶）也没有显著影响。此外，P4-3未引起胰腺炎的风险，这与某些CD26抑制剂存在副作用不同，进一步验证了其在临床转化中的潜力。在肿瘤模型中，P4-3的治疗效果得到了验证，无论是通过亚皮下肿瘤模型还是体内肺部肿瘤模型，均观察到P4-3能够显著抑制肿瘤生长，同时保持宿主体重稳定。

在临床转化方面，研究团队利用患者来源的类器官模型进一步验证了P4-3的治疗效果。结果显示，P4-3在类器官模型中能够有效降解CD26，并诱导细胞凋亡，而对周围正常组织的抑制率较低，表明其具有良好的安全性和靶向性。此外，研究还发现P4-3在体外和体内均能有效降低ROS水平，增加DNA损伤，并影响线粒体膜电位，这些变化与细胞凋亡密切相关。

研究团队还通过多种实验方法探索了P4-3的分子机制。例如，通过共免疫沉淀（Co-IP）确认了CD26与ADA的相互作用，通过荧光显微镜和流式细胞术分析了ROS和DNA损伤的产生，通过透射电镜（TEM）观察了线粒体结构的变化。这些实验不仅揭示了P4-3诱导CD26降解的分子机制，还为开发针对CD26的新型治疗策略提供了理论依据。

此外，研究还发现P4-3在处理CD26阴性NSCLC细胞系时表现出较强的抑制作用，而在处理正常细胞时则几乎无影响，这进一步证明了其在临床中的应用潜力。通过转录组学分析，研究团队发现P4-3能够显著改变细胞内的基因表达，影响多个生物学过程，包括细胞凋亡信号通路。这些发现表明，P4-3的治疗效果不仅局限于CD26的直接作用，还可能通过多种间接机制实现。

在研究的未来方向中，团队提出将进一步探索P4-3在与EGFR/ALK抑制剂联合使用时的协同效应，以及其在其他CD26异常表达的癌症中的应用潜力。此外，研究还强调了对P4-3长期生物相容性的评估，以及其在不同肿瘤微环境中的表现，特别是其在脑转移情况下的血脑屏障穿透能力。这些研究将有助于进一步优化PROTACs的设计，并拓展其在肺癌治疗中的应用范围。

总之，这项研究通过设计和验证针对CD26的PROTACs，为缺乏驱动突变的NSCLC患者提供了一种新的治疗策略。P4-3不仅在体外和体内模型中表现出显著的抗肿瘤效果，还通过独特的分子机制实现了对CD26的双重靶向作用，从而显著提高了治疗效果。这些发现为开发更广泛适用的肺癌治疗药物提供了重要的科学依据，并有望为临床治疗提供新的思路和方法。