寒冷暴露诱发的β-羟基丁酸能够促进棕色脂肪线粒体脂滴与肝脏细胞的接触，从而改善脂肪代谢紊乱和肝脂肪变性

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Cold exposure-induced β-hydroxybutyrate promotes brown fat mitochondrial lipid droplet contact to ameliorate fatty dysfunction and hepatic steatosis

β-羟基丁酸通过靶向RAB10-PLIN5复合物促进褐色脂肪组织线粒体-脂滴接触，改善代谢功能，为肥胖和肝脂肪变性治疗提供新靶点。

　　冷暴露能够激活棕色脂肪组织（BAT），从而缓解代谢紊乱。然而，BAT中线粒体脂滴接触（MLC）的调控机制及其与这些益处之间的关系尚不清楚。本研究识别出肝脏来源的β-羟基丁酸（BHB）是驱动BAT中MLC形成的关键介质。从机制上看，BHB直接作用于RAB10的GLY-67残基，增强其与PLIN5的相互作用，形成RAB10–PLIN5复合物，从而促进MLC的形成。这种相互作用通过SPIDER和生物素标记的pull-down实验得到了验证。功能上，BHB治疗可减轻饮食诱导肥胖小鼠的脂毒性并改善代谢健康。这些发现确立了BHB在BAT MLC与系统代谢益处之间的关键联系，突出了RAB10–PLIN5复合物作为肥胖和肝脂肪变性的治疗靶点的潜力。此外，这项研究还强调了冷诱导代谢适应在对抗代谢疾病中的更广泛意义。

在本研究中，我们探讨了冷暴露对多种组织和器官的影响。通过将C57BL/6J小鼠暴露于急性冷暴露（4°C持续6、12或24小时）和慢性冷暴露（4°C持续3、7、14、20或30天），并维持对照组小鼠在23°C的环境。结果表明，急性冷暴露在24小时后显著增加了BAT的重量，而在慢性暴露中观察到BAT重量的持续增长。相反，附睾脂肪（eWAT）和腹股沟脂肪（iWAT）在冷暴露6小时内出现重量和面积的减少，并且这种减少在长期暴露期间持续存在。有趣的是，在20天的冷暴露后，体重大幅下降，伴随BAT颜色变深，但到了30天时，组织重量增加，BAT颜色变浅，这表明了适应性反应的存在。HE染色显示，冷暴露改变了BAT的结构，使其呈现多孔脂滴结构，这一变化在第3天和第20天最为明显，但在第30天有所减弱。同时，eWAT和iWAT的脂肪细胞大小和数量在整个冷暴露过程中都减少。值得注意的是，在30天的暴露期间，肝组织未观察到结构异常。肝重与体重的比例在冷暴露过程中没有显著变化。心脏重量与体重的比例在急性暴露时增加，而在慢性冷暴露时降低。在30天的暴露后，心肌细胞肥大现象明显，通过HE染色和小麦胚凝集素（WGA）染色得到确认。尽管如此，心脏和肝脏的血浆损伤标志物（如LDH、ALT和AST）在整个暴露过程中仍保持在正常范围内。多普勒超声分析显示，在急性冷暴露期间，主动脉流出道的舒张和收缩直径以及血流比值没有显著变化。然而，在30天的暴露后，主动脉直径差异和正向-反向血流比值显著降低。此外，心脏射血分数（EF）和缩短分数（FS）在冷暴露过程中有所下降，但在20天内仍处于生理正常范围。冷暴露诱导了显著的脂肪组织变化，包括BAT质量的增加、白色脂肪细胞大小和数量的减少以及BAT多孔性，这些效应伴随着体和器官重量的暂时性减少，但并未引发肝脏或心脏结构的病理变化。在30天后，适应性机制似乎缓解了这些变化，使器官重量和BAT形态恢复正常。这些发现表明，冷暴露可以增强BAT活性并减少白色脂肪，而不会对关键代谢器官造成有害影响。为了理解BAT在冷暴露期间的分子适应性，我们对对照组小鼠（23°C）和冷暴露小鼠（4°C暴露3天）的BAT进行了转录组分析。总共鉴定出779个差异表达基因（DEGs），其中419个基因在冷暴露小鼠中上调，360个基因下调。GO功能富集分析显示，上调基因与脂滴、脂肪酸代谢和脂质代谢过程相关，同时涉及基础细胞过程如核苷酸结合和细胞因子调节。热图显示，脂肪酸氧化（FAO）相关基因，包括Hadha、Ucp1和Pdk1，显著上调，而脂肪酸合成和脂滴相关的基因则下调。GSEA分析表明，冷暴露显著影响与脂肪代谢相关的通路。这些发现强调了冷暴露下BAT的代谢重编程。

为了进一步理解BHB在冷暴露中如何促进BAT中的MLC，我们进行了BHB靶向蛋白质的识别。通过合成生物素标记的BHB探针并使用SPIDER实验，我们发现RAB10是BHB的主要靶点之一，与BAT中的脂滴相互作用密切相关。结合转录组和代谢组的分析，我们确定了39个可能调控代谢变化的基因，其中羟酰辅酶A脱氢酶三功能复合物α亚基（Hadha）是BHB的关键调控因子。HADHA是线粒体三功能酶复合物的组成部分，在BAT和肝脏中主要参与长链脂肪酸的β-氧化，这两个组织是脂肪酸代谢和产热的关键部位。冷暴露显著提高了小鼠血浆中的BHB水平。为了模拟冷诱导的BAT激活，我们对小鼠进行了β3-肾上腺素受体激动剂CL-316,243（1.0 mg/kg）或生理盐水的处理，持续3或7天。激动剂处理的小鼠血浆BHB水平显著增加，与冷暴露的效果相似。与代谢组结果一致，冷暴露显著提高了BAT中Hadha的mRNA水平，进一步支持其在BHB生成和脂肪酸代谢中的作用。Western blot分析显示，冷暴露3天和20天后，BAT中的UCP1和HADHA蛋白表达显著增加。这与转录组发现一致，强化了HADHA在长链脂肪酸氧化生成乙酰辅酶A，作为BHB合成前体中的作用。这些结果表明，冷诱导的BHB水平升高可能依赖于BAT中HADHA的表达增强。为了探讨BAT在BHB生成中的贡献，我们对进行了BAT移植和假手术的C57BL/6J小鼠进行了冷暴露。ELISA检测显示，即使移除了BAT，循环中的BHB水平仍然升高，表明其他组织在冷暴露中也参与了BHB的生成。鉴于肝脏是BHB生成的主要场所，我们检测了冷暴露期间肝脏中的HADHA表达。Western blot分析显示，冷暴露小鼠肝脏中的HADHA蛋白水平显著增加。同时，肝脏中乙酰辅酶A的合成也有所增加，这是BHB合成的重要底物。在肝脏中过表达HADHA可提高BHB水平，而HADHA敲低则会降低BHB水平。这些结果证实了肝脏HADHA在BHB生成中的关键作用。冷暴露导致肝脏HADHA合成增加，进而导致乙酰辅酶A增加，最终促进BHB的生成。为了探讨肝脏BHB生成与BAT中利用之间的相互作用，我们进行了共培养实验。过表达HADHA的原代肝细胞与成熟的棕色脂肪细胞共培养，显著提高了棕色脂肪细胞中的BHB含量。这表明肝脏中生成的BHB被运输到BAT，用于代谢过程。我们体内测量发现，小鼠的基础血浆BHB水平在0.4至0.5 mmol/L之间。在冷暴露后，血浆中的BHB水平显著增加至0.8至1.2 mmol/L。为了在体外模拟这一生理范围，我们选择了1 mmol/L作为主要浓度进行研究。为了进一步探索BHB剂量依赖性，我们还包含了5和10 mmol/L的BHB条件。为了评估BHB对棕色脂肪细胞的代谢影响，我们诱导3T3-L1细胞和SVF细胞分化为成熟的棕色脂肪细胞，然后用不同浓度的BHB（1、5和10 mmol/L）进行处理。油红O染色显示，10 mmol/L的BHB显著减少了棕色脂肪细胞中的脂质含量。进一步分析表明，BHB处理增强了脂肪酸β-氧化相关基因（Ppara、Cpt1a、Mcad）的表达，同时减少了脂滴接触相关基因（Cidea）的表达。然而，BHB对与脂肪细胞分化、脂质合成或脂解相关的基因（如Fasn和Atgl）影响较小。为了评估HADHA在代谢相关脂肪肝疾病（MASLD）和脂肪性肝炎（MASH）中的作用，我们检测了MASLD/MASH小鼠模型中的肝脏HADHA表达。高脂肪饮食诱导的MASLD/MASH模型（HFCDAA、HFHFHC饮食和ApoE-/-小鼠）显示，与对照组相比，肝脏中HADHA蛋白表达显著减少。相应地，MASLD/MASH小鼠的循环BHB水平也下降。这些发现表明，肝脏HADHA表达的减少与BHB水平的下降可能与MASLD的进展有关。

BHB通过促进RAB10与PLIN5的相互作用来增强棕色脂肪细胞中的线粒体-脂滴接触。为了进一步理解这种相互作用如何促进脂滴与线粒体的接触，我们进行了RAB10和PLIN5的免疫共沉淀和分子对接实验。结果表明，BHB的加入显著增强了RAB10与PLIN5的结合能力。这些发现表明，BHB作为分子调节因子，通过加强RAB10–PLIN5相互作用来促进细胞器接触。PLIN5的敲低显著减弱了BHB（10 mmol/L）促进MLC的效果，同时抑制了最大线粒体呼吸能力，即使在BHB浓度增加的情况下也是如此。这些结果表明，PLIN5在RAB10介导的MLC功能中起着关键作用，尤其是在BHB调控下。

除了代谢改善外，BHB还显著降低了血浆中的非酯化脂肪酸（NEFA）、甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平，这些指标均与循环BHB浓度呈负相关。肝脏组织学分析进一步表明，BHB治疗显著改善了高脂肪饮食诱导的肝脂肪变、肝细胞气球样变和脂质积累，这在组织学评分和多普勒超声测量的肝叶直径中得到反映。同样，BHB治疗后肝脏TC和TG水平显著降低。此外，BHB恢复了肝脏FAO能力，该能力在高脂肪饮食喂养后受损。肝脏FAO能力与循环BHB水平呈正相关。qPCR分析进一步表明，BHB上调了肝脏中FAO相关基因（如Cpt1a和Ppara）的表达。为了评估这些发现的临床意义，我们分析了MASLD患者和健康对照的血浆样本。与动物研究一致，MASLD患者表现出显著低于健康个体的循环BHB水平。

此外，高脂肪饮食喂养的小鼠出现了明显的心脏收缩功能障碍，包括射血分数（EF）和缩短分数（FS）的减少。BHB治疗显著改善了这些心脏参数，恢复了正向-反向血流比，并正常化了主动脉流出道内径比。这些结果表明，BHB在改善肥胖相关代谢紊乱方面具有多方面的益处，包括增强脂肪组织功能、促进BAT中的MLC形成、防止脂肪细胞肥大、促进脂质清除以及减轻肝脂毒性与心脏功能障碍。这些多方面的益处突显了BHB在治疗与BAT功能受损和脂质紊乱相关的代谢疾病中的潜力。

肝脏在系统能量稳态中起着核心作用，并且是BHB生成的主要场所。我们的研究强调了肝脏BHB在调节BAT中MLC形成中的关键作用，同时确定了肝脏HADHA表达作为调控因素的重要性。来自过表达HADHA肝细胞的上清液在共培养的BAT中显著增强了MLC形成，表现为较小的脂滴、脂肪酸从脂滴向线粒体的转运增加以及线粒体FAO能力的提升。相反，肝脏HADHA敲低会损害这些过程，而BHB补充可以恢复线粒体脂肪酸利用。此外，肝脏HADHA的表达还影响了BAT中MLC的形成，这在冷暴露下尤为明显。电子显微镜观察显示，高脂肪饮食喂养的小鼠BAT中MLC减少，而冷暴露显著增强MLC。这种增强在HADHA缺陷小鼠中显著减弱，但在BHB补充后得以恢复。HE染色显示，冷暴露减轻了高脂肪饮食诱导的肝脂肪变和脂毒性，而肝脏HADHA敲低则削弱了这些效果，BHB治疗则可以恢复。同样，肝脏多普勒超声显示冷暴露改善了肝脂沉积并减少了右肝叶的斜径，这些效应在肝脏HADHA敲低后减弱，但在BHB补充后恢复。这些结果表明，肝脏HADHA介导的BHB生成在冷暴露下促进了BAT中的MLC形成，从而减轻了肝脂肪变和脂毒性。

综上所述，本研究揭示了BHB在连接肝脏代谢与BAT功能中的关键作用。通过促进RAB10–PLIN5复合物的形成，BHB增强了线粒体效率和脂质利用，为应对肥胖、MASLD及相关代谢紊乱提供了新的治疗途径。我们的发现强调了器官间交流在代谢调节中的重要性，并提出了利用这些通路对抗代谢疾病的新策略。然而，本研究的局限性在于，尽管我们获得了关于BHB在小鼠BAT中调控MLC的重要见解，但其在人类BAT中的可转化性仍不确定。人类BAT在代谢活性、产热能力和解剖分布方面与小鼠模型存在显著差异，这可能限制了这些发现的临床应用。此外，我们的研究主要集中在肝脏BHB和BAT，未充分探索其他代谢活跃器官，如骨骼肌或中枢神经系统，在冷暴露系统效应中的作用。未来需要进一步研究这些更广泛的器官间相互作用及其在冷诱导代谢适应中的贡献，以全面阐明BHB的治疗潜力。