RPS24微外显子剪接异构体：ER阳性乳腺癌进展与治疗耐药的新颖生物标志物

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：RPS24 microexon isoform as a novel biomarker for estrogen receptor-positive breast cancer progression and therapeutic resistance

本研究聚焦雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌中RPS24基因微外显子剪接的调控机制及其临床意义。研究人员通过生物信息学分析与实验验证，发现包含3-bp微外显子的RPS24剪接异构体（ex4:3bp）受PTBP1调控，并与ER信号通路、细胞周期及mTOR/CDK4/6抑制剂响应密切相关。该异构体在ER+乳腺癌中高表达，但在耐药及转移样本中下调，提示其可作为预测治疗反应及疾病进展的动态生物标志物。此项研究为理解乳腺癌耐药机制提供了新视角，并为开发新的治疗策略奠定了基础。

　　

在乳腺癌，尤其是雌激素受体阳性（ER+）亚型的研究领域，科学家们一直致力于揭示肿瘤进展和治疗耐药的复杂机制。尽管针对ER信号通路的内分泌治疗和针对细胞周期的CDK4/6抑制剂已显著改善患者预后，但耐药性的出现仍然是临床面临的主要挑战。近年来，基因表达的转录后调控，特别是选择性剪接（Alternative Splicing, AS），被发现在癌症中扮演着越来越重要的角色。它允许一个基因产生多个功能不同的mRNA异构体，从而极大地增加了蛋白质组的多样性，并可能驱动疾病的异质性和进展。然而，由于技术上的挑战，对短小遗传区域（如长度小于30个核苷酸的微外显子）的剪接动态进行分析仍然十分困难。

ribosomal protein S24 (RPS24) 基因正是一个典型的例子，它包含三个连续的微外显子（3-bp, 18-bp, 和 22-bp）。以往的研究多聚焦于较长的22-bp外显子，而对整个微外显子簇的全面调控机制及其在癌症中的功能知之甚少。此前有数据库（AS-CMC）提示RPS24的剪接模式在多种癌症中存在亚型特异性，尤其是在乳腺癌中，这引发了研究人员的浓厚兴趣。他们推测，深入剖析RPS24的剪接变异，或许能揭示乳腺癌，特别是ER+乳腺癌新的生物学见解和潜在的临床生物标志物。

为了回答这些关键问题，由 Jiyeon Park、Dahye Nam、Seung-Hyun Jung 和 Bin Tian 共同完成，通讯作者为 Yeun-Jun Chung 教授的研究团队在《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》上发表了他们的最新研究成果。他们旨在系统性地描绘RPS24在乳腺癌中的剪接图谱，阐明其调控机制，并评估其临床意义，特别是作为治疗反应和耐药性生物标志物的潜力。

研究人员综合运用了多种关键技术方法来开展这项研究。首先，他们利用公共数据库（如CCLE, TCGA, CPTAC, MBC项目）获取了大量乳腺癌细胞系和患者组织的RNA测序（RNA-seq）数据，并开发了一种基于剪接连接点（splice junction）读数的生物信息学方法，专门用于精确量化RPS24的三个主要剪接异构体（包含3-bp外显子的ex4:3bp、包含22-bp外显子的ex4:22bp、以及跳过所有微外显子的ex4:ex6）。为了验证生物信息学分析的可靠性，他们使用了片段分析（Fragment Analysis）这一实验技术，在11株乳腺癌细胞系中对RPS24异构体进行了定量验证，结果显示两种方法高度一致。此外，为了探索上游调控因子，他们分析了系统性剪接因子敲低数据集，并结合了计算机预测（RBPmap）和实验验证（CLIP-seq数据）来鉴定关键的RNA结合蛋白（如PTBP1）。研究还涉及了对药物处理（如mTOR抑制剂Everolimus、CDK4/6抑制剂Palbociclib/Abemaciclib）和耐药模型（他莫昔芬耐药、帕博西利耐药等）细胞系的转录组分析，以观察RPS24剪接对治疗干预的动态响应。

Characterizing RPS24 AS Isoforms in Breast Cancer Cell Lines

研究人员首先在51株CCLE乳腺癌细胞系中分析了RPS24的剪接模式，发现了显著的异质性。ex4:22bp和ex4:ex6连接点在绝大多数细胞系（96%）中表达超过5%，而ex4:3bp连接点仅在约三分之二的细胞系（34/51）中检测到，18-bp外显子则基本不表达。通过片段分析实验在11株细胞系中进行验证，成功分离并定量了三个主要的异构体（ex4:3bp, ex4:22bp, ex4:ex6），并且与RNA-seq数据计算结果高度相关（r>0.8），证明了其生物信息学方法的可靠性。进一步分析发现，这些异构体导致RPS24蛋白C末端氨基酸序列不同，但ex4:3bp转录本水平与RPS24总蛋白丰度呈负相关，提示可能存在转录后或翻译后调控机制。

RPS24 AS Isoform Composition Is Regulated by Estrogen Receptor in Breast Cancer

分析显示，RPS24剪接模式与乳腺癌分子亚型密切相关。ex4:3bp异构体在ER阳性（ER+）和管腔（Luminal）型细胞系中显著高表达，而在ER阴性（ER-）和基底（Basal）型中表达较低。ex4:3bp的表达量与ESR1（编码ERα）的mRNA水平呈强正相关（r=0.7），并且与ESR1基因依赖性（通过RNAi和CRISPR-Cas9敲除评估）呈负相关，意味着高表达ex4:3bp的细胞更依赖ESR1生存。在携带ESR1基因配体结合域突变（如Y537S, D538G）的细胞系中，ex4:3bp的比例显著下降，且不受雌激素刺激的显著影响。此外，来自其他数据集（GSE173631）的证据表明，ERα与RPS24在多个层面存在相互作用：包括胞浆内的蛋白质-蛋白质相互作用、与RPS24 pre-mRNA和3‘UTR的结合、以及通过CRISPR干扰ERα结合位点证实RPS24对乳腺癌细胞存活至关重要。

Differential Regulation of Ex4:3bp Isoform by Cell Cycle/mTOR Inhibition and in Endocrine Therapy Resistance

研究团队进一步探索了ex4:3bp对治疗干预的反应。在MCF7细胞中，mTOR通路抑制（通过INK128、雷帕霉素或饥饿）和CDK4/6抑制（Abemaciclib或Palbociclib）均能显著上调ex4:3bp异构体的比例。这种上调仅在视网膜母细胞瘤蛋白（RB）阳性的细胞中发生，表明ex4:3bp可能作为细胞周期通路活性的指示器。即使在携带ESR1突变（D538G, Y537S）的细胞中，CDK4/6抑制剂单药或联合治疗（联合雌激素剥夺或氟维司群）也能上调ex4:3bp，但其基础水平和响应模式与野生型ESR1不同。与此形成鲜明对比的是，在多种获得性耐药模型（包括对他莫昔芬、氟维司群、帕博西利耐药）的细胞中，ex4:3bp的表达均一致性地显著下调。这些结果表明，ex4:3bp是一个动态的生物传感器，在治疗有效时上调，在耐药时下调。

Identification of PTBP1 as an Upstream Regulator of RPS24 Alternative Splicing

为了寻找调控RPS24剪接的上游因子，研究人员筛选了一个系统性敲低305个剪接因子的数据集。发现在不表达ex4:3bp的HeLa细胞中，敲低PTBP1和U2AF1能显著增加ex4:22bp的比例。计算机模拟（RBPmap）和CLIP-seq实验数据均证实，PTBP1能结合在三个微外显子上游内含子区的多聚嘧啶束（polypyrimidine tract）上的特定基序（CUUUCU）。在MCF7乳腺癌细胞中敲低PTBP1，导致ex4:3bp和ex4:22bp异构体表达均显著增加（分别增加2.2倍和1.7倍），而ex4:ex6（跳过微外显子）减少。这证明PTBP1是RPS24微外显子包含（inclusion）的关键抑制因子。

Ex4:3bp as a Potential Clinical Biomarker in Breast Cancer

最后，研究团队在临床患者队列中验证了ex4:3bp的潜在价值。TCGA和CPTAC数据分析均显示，ex4:3bp在管腔A型（LumA）和管腔B型（LumB）乳腺癌中的表达显著高于HER2富集型和基底样型。在TCGA数据中，ex4:3bp表达与反映上皮分化状态的外胚层（Ectoderm）评分呈正相关（尤其在ER+样本中，r=0.44），而与中胚层（Mesoderm）、内胚层（Endoderm）及干性（Stemness）评分相关性较弱或为负相关，提示其与维持上皮特性相关。虽然ex4:3bp在原发性肿瘤中与总生存期或肿瘤分期无显著关联，但在转移性乳腺癌（MBC）项目数据中，其表达在ER+样本中高于ER-样本，并且在发生远处淋巴结转移的ER+患者中显著降低，表明其表达下调与转移进展相关。

综上所述，本研究揭示了RPS24选择性剪接，特别是ex4:3bp微外显子异构体，在ER阳性乳腺癌中扮演着关键角色。它处于一个复杂的调控网络中心，整合了ER信号、细胞周期调控（通过mTOR和CDK4/6通路）以及PTBP1介导的剪接调控。该异构体作为一个动态的分子传感器，其表达在治疗有效时上调，在获得性耐药和转移进程中下调。因此，ex4:3bp有潜力成为预测ER+乳腺癌治疗反应和疾病进展的新型生物标志物。这项研究不仅深化了对乳腺癌生物学机制的理解，特别是剪接调控在治疗耐药中的作用，也为开发新的治疗策略和临床监测工具提供了重要的理论依据和实验证据。未来的研究需要进一步阐明ERα直接调控RPS24剪接的分子机制，明确不同RPS24蛋白异构体的功能差异，并在前瞻性临床试验中验证其临床效用。