RNA相关糖复合物揭示糖RNA分析中的潜在模糊性：对N-糖基化小RNA检测方法的重新评估

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：RNA-associated glycoconjugates highlight potential ambiguities in glycoRNA analysis

本研究针对糖RNA（glycoRNA）检测中可能存在的共纯化糖复合物干扰问题，通过对比早期点击与晚期点击策略、多种RNA纯化方法及酶解实验，发现非RNA来源的N-糖复合物在常规糖RNA分析中难以区分。研究提出以直接上样替代硅胶柱纯化作为关键质控点，为糖RNA研究提供了重要的方法学警示。

　　

在生命科学领域，突破性发现往往伴随着对研究方法的深入审视。2021年，一项发表于《细胞》杂志的研究首次报道了哺乳动物细胞中存在N-糖基化修饰的小RNA分子——糖RNA（glycoRNA），这一发现迅速拓展了人们对RNA转录后修饰的认识边界。随后的研究表明，这些位于细胞表面的糖RNA可能通过与Siglec家族受体或P-选择素相互作用，在先天免疫和癌症生物学中发挥重要功能。然而，在这一新兴领域快速发展的同时，其核心检测方法的可靠性亟待验证。

糖RNA的原始发现依赖于代谢聚糖标记策略与相分离RNA提取技术的结合。研究人员使用N-叠氮乙酰甘露糖胺（Ac₄ManNAz）代谢标记唾液酸，通过铜游离的应变促进炔-叠氮环加成反应（SPAAC）将生物素或荧光基团连接到糖RNA上。然而，这种检测方法的核心前提是：经过蛋白酶K、DNase和RNase等多轮酶解及硅胶柱纯化后，仅糖RNA能够被特异性保留。正是这个看似严谨的实验设计，引起了来自韩国基础科学研究所、荷兰代尔夫特理工大学等四个研究团队的科学家的警觉。

发表在《实验与分子医学》（EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE）上的这项研究，通过系统的实验证明，常规RNA提取方法中共同纯化的非RNAN-糖复合物，其生化特性与先前报道的糖RNA高度相似，可能导致对糖RNA的错误鉴定。研究人员发现，这些N-糖复合物能够耐受多种核酸酶（包括RNase A、RNase T1、benzonase和nuclease P1）的消化，且在整个RNA制备过程中持续存在，但在使用硅胶柱纯化RNase处理后的样品时，这些信号会消失，造成“RNase敏感”的假象。

为开展这项研究，团队运用了几个关键技术方法：代谢糖标记技术（使用Ac₄ManNAz）、酸性硫氰酸胍-酚-氯仿（AGPC）相分离和硅胶柱两种RNA提取方法、应变促进炔-叠氮环加成（SPAAC）点击化学、多种酶解实验（RNases、PNGase F、神经氨酸苷酶等）、化学合成新糖RNA（neo-glycoRNA）模型以及通过调节乙醇浓度和添加外源RNA的硅胶柱吸附实验。研究使用了HeLa细胞和K562细胞。

重新验证已报道的糖RNA观察结果

研究人员首先严格遵循已报道的工作流程（晚期点击程序），成功复现了先前观察到的现象：在高表观分子量位置（接近28S rRNA）检测到荧光信号，且该信号在RNase A处理后消失。然而，当将点击反应提前至消化酶处理之前（早期点击程序）时，他们发现即使跳过蛋白酶K处理，仍能观察到额外的高分子量条带，提示可能存在共同纯化的糖肽。

RNA纯化方法导致RNase敏感性的差异

研究团队设计了一套绕过硅胶柱纯化的独立工作流程。令人惊讶的是，在这种方法中，唾液酸叠氮（SiaNAz）标记的荧光条带在RNase处理后仍然保持完整，而总RNA已被完全降解。这种RNase抗性与可视化方法无关，在所有采用的方法中均一致。进一步对比实验表明，使用硅胶柱纯化RNase处理后的样品会导致糖信号丢失，而使用AGPC（TRIzol）纯化则能保留信号。这一关键差异表明，硅胶柱纯化步骤本身是造成表观RNase敏感性的原因，而非真正的酶解。

RNase抗性糖复合物被N-糖修饰但不是RNA分子

研究人员使用多种酶（PNGase F、α2-3,6,8,9神经氨酸苷酶A）证实，这些RNase抗性分子含有复杂的N-糖链且末端带有唾液酸，其酶解特性与报道的糖RNA相似。为探究其化学本质，团队合成了人工N-糖基化RNA（新糖RNA）。有趣的是，与共同纯化的糖复合物不同，新糖RNA在凝胶中的迁移行为与其未修饰的对应物相似，且其荧光信号在RNase处理后消失，表明N-糖基化并不能赋予RNA对RNase的抗性。这进一步支持了共同纯化的N-糖复合物并非RNA分子。

增加乙醇浓度增强RNA相关N-糖复合物在硅胶上的吸附

研究人员通过改变硅胶柱上样缓冲液中的乙醇或异丙醇浓度（20%至80%）发现，N-糖复合物的吸附遵循硅胶系统的一般规律：上样缓冲液中疏水成分越多，分子在硅胶树脂上的保留越好。在50%乙醇浓度下，RNase处理后的糖复合物无法被回收；而当乙醇浓度升高至60%及以上时，即使经过RNase处理，糖信号也能被有效回收。这表明RNA的存在通过某种机制促进了糖复合物在硅胶上的吸附。

外源RNA促进N-糖复合物在硅胶柱上的吸附

救援实验表明，向RNase处理后的样品中添加外源总RNA（来自未标记的HeLa细胞或K562细胞），能够有效恢复N-糖复合物在50%乙醇浓度下在硅胶柱上的回收。即使是十分之一量的RNA也足以完全恢复回收效果。部分片段化的RNA也具有相同的促进作用，而完全降解的RNA或质粒DNA则无此效果。这证明RNA（而非DNA）作为共沉淀剂，与N-糖复合物存在相互作用，从而在基于硅胶柱的提取方法中导致它们的共分离。

本研究揭示了当前糖RNA生化分析中一个重要的方法学模糊地带。研究表明，在哺乳动物细胞的RNA制备物中，持续存在一种非RNA来源的N-糖复合物，其在与凝胶电泳和酶解分析相关的多个特性上与先前报道的糖RNA高度相似。最关键的是，常规使用的硅胶柱纯化步骤会在RNA被降解后，物理性地耗竭这些N-糖复合物，从而错误地呈现出“RNase敏感”的表现。研究通过化学合成的新糖RNA模型证明，真正的糖RNA并不会因糖基化而获得RNase抗性。

基于这些发现，研究团队提出了一个简单的质控实验建议：在进行RNase处理后，避免使用硅胶柱纯化样品，而是直接将反应混合物上样进行凝胶电泳。如果高分子量条带在RNase处理后仍然存在，则警示存在非RNA N-糖复合物的共同纯化。这项研究为快速发展的糖RNA领域提供了关键的方法论警示，强调需要开发更特异性的方法来确证糖RNA的存在和功能。尽管本研究并未最终阐明这些共同纯化的N-糖复合物的确切化学本质（推测可能是蛋白K无法完全降解的N-糖基化寡肽），但它为未来更可靠地研究糖RNA及其他新型糖缀合物奠定了重要基础。