综述：双链断裂修复中RNA反应的多层作用

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：The multiple layers of RNA response in double-strand break repair

这篇综述系统阐述了RNA在DNA双链断裂修复中的多重作用机制，揭示了RNA不仅可作为结构支架（RNA桥接）和修复模板（RNA模板化修复），还能通过RNA:DNA杂交体、调控蛋白招募等方式精细调控非同源末端连接（NHEJ）、微同源介导末端连接（MMEJ）和同源重组（HR）等关键通路，为理解基因组稳定性维持和开发新型基因编辑技术提供了重要理论支撑。

　　

RNA在DNA双链断裂修复中的多重角色

长期以来被视为遗传信息被动信使的RNA，如今在DNA双链断裂修复领域展现出前所未有的活跃度。最新研究表明，RNA分子能够作为基因组损伤的"第一响应者"，通过多种机制参与修复过程，包括作为结构支架、信息模板以及调控信号分子。

RNA在末端连接修复中的作用

在真核生物中，非同源末端连接是修复DNA双链断裂的主要途径。传统观点认为该过程不需要模板，但最新研究发现内源性新生转录本能够通过RNA介导的末端连接机制直接指导修复。

RNA介导的非同源末端连接机制中，转录产生的RNA分子通过与DNA断裂末端形成RNA:DNA杂交体，起到"分子桥"的作用，将断裂末端拉近并保持适当位置。这一过程依赖于Ku70/Ku80异源二聚体等核心NHEJ因子，且DNA聚合酶η可能通过其逆转录酶活性参与缺口填补。

在微同源介导的末端连接中，RNA转录本能够跳过内含子序列，通过外显子衍生的微同源区域促进末端连接。DNA聚合酶θ在这一过程中显示出独特的结构可塑性，能够容纳RNA:DNA杂交体并发挥逆转录酶活性。

RNA:DNA杂交体的调控功能

R环是由RNA:DNA杂交体和 displaced的单链DNA组成的三链核酸结构。在转录活跃区域，R环的形成对修复通路选择具有早期调控作用。这些结构能够通过空间位阻抑制MRE11和EXO2等核酸酶的活性，从而促进NHEJ而非同源重组。

R环的及时解离对有效启动NHEJ至关重要。外切酶XRN2促进RNA:DNA杂交体的解离，使Ku70能够接触并保护DNA末端。此外，RNA甲基转移酶TRDMT1催化的5-甲基胞嘧啶修饰能够抑制替代性MMEJ通路的激活，通过限制PARP1的招募来维持基因组稳定性。

RNA在同源重组通路中的直接参与

RNA模板化DSB修复机制表明，天然RNA分子无需经过cDNA合成即可作为同源修复模板。在酿酒酵母中的研究表明，具有断裂基因同源性的RNA能够有效指导修复，这一过程在RNase H缺失突变体中显著增强。

RAD52蛋白在这一过程中发挥关键作用，能够促进RNA与DNA的逆向链交换。生化研究表明，酵母和人类RAD52都能结合断裂的双链DNA，并促进与同源单链RNA的逆向链交换，稳定RNA:DNA杂交体并促进聚合酶招募。

DNA聚合酶ζ被鉴定为介导RNA模板化修复的主要聚合酶，其在逆转录活性方面显著优于其他细胞DNA聚合酶。在人类细胞中，DNA聚合酶ζ同样被证明是RNA模板化修复的关键逆转录酶，这一发现强调了该酶在物种间的保守性和核心地位。

转录调控与间接作用机制

DNA断裂位点的转录活性现已被认为是修复通路选择的关键调节因子。增强局部转录或提供同源RNA能够显著提高基因转换频率，而RNA聚合酶II的抑制则会减少RPA、RAD51和BRCA1/2焦点的形成。

断裂诱导的长链非编码RNA是转录调控的重要媒介。MRN复合物招募Pol II至DNA末端，组装最小转录复合物，产生跨越断裂位点数千碱基的双向dilncRNA。这些转录本被Drosha和Dicer共同转录加工成短双链体，产生DNA损伤应答RNA，通过碱基配对返回到断裂位点。

RNA修饰进一步精细调控HR准确性。TRDMT1在杂交体RNA链上沉积m⁵C修饰，增强RAD52结合。同时，ATM磷酸化的METTL3向dilncRNA添加m⁶A，YTHDC1保护这些修饰的杂交体免于过早解旋，维持BRCA1/RAD52保留以促进高效同源搜索。

DNA末端切除的动态调控

DNA断裂后立即积累的RNA:DNA杂交体主动塑造末端处理过程，而非仅仅是转录的被动副产物。全基因组DRIP-seq和生化研究表明，diRNA在切除后数分钟内与新暴露的3'单链DNA尾部退火，形成断裂诱导杂交体，覆盖病变两侧。

这些早期杂交体保护悬垂末端免受外切酶降解，并招募RAD52和BRCA1。Pol III被MRN招募至3'尾部进行转录，产生RNA-DNA帽结构，进一步稳定悬垂末端并促使断裂倾向于HR。

RNA:DNA杂交体的动态性至关重要。RNase H1的过表达会过早去除杂交体，触发过度双向切除和大型缺失。因此，RNA:DNA杂交体作为停止信号来限制EXO1和DNA2等核酸酶活性。

研究方法的创新与发展

为深入解析RNA在DSB修复中的作用，研究人员开发了多种创新型实验方法。报告基因系统通过工程化构建体整合调控RNA元件，实现对RNA介导修复机制的可控研究。测序技术的进步使得能够在核苷酸分辨率下表征修复结果，包括高通量基因组易位测序、线性扩增介导的高通量基因组易位测序等方法。

体外筛选方法在无细胞环境中评估核酸酶切割效率和剖析工程变体方面不可或缺。Digenome-seq、SITE-Seq和CIRCLE-seq等方法能够在无细胞内环境下分析RNA对修复过程的影响。

最新发展的体内染色质定位技术，如BLESS、BLISS、END-seq和DSB-Capture等，能够在天然染色质环境中进行DSB定位，为研究RNA在真实细胞环境中的功能提供了有力工具。

RNA生物技术在基因组工程中的应用

RNA模板化编辑技术，特别是prime editing系统，代表了基因组工程领域的重要突破。这一系统将Cas9切口酶与逆转录酶融合，通过prime editing guide RNA引导，实现精确的插入、缺失和碱基替换，而无需诱导DSB或需要供体DNA模板。

与传统DNA同源定向修复相比，RNA模板具有多重优势：pegRNA将引导和模板功能整合于单个分子，简化了递送过程并降低了组分分离导致的脱靶风险；RNA的瞬时性质降低了长期表达风险和基因组整合可能性；RNA模板编辑在非分裂细胞中保持活性，扩展了基因编辑的应用范围。

Prime editing系统的持续优化推动了该领域的发展。从最初的PE1到PE2、PE3，再到结合显性阴性MLH1突变体的PE4和PE5，编辑效率不断提高。PEmax通过密码子优化、额外核定位信号和增强的Cas9活性显著提升编辑性能。最近通过噬菌体辅助进化和RT工程开发的PE6，在尺寸受限系统中实现了更好的功能性。

未来展望与挑战

尽管RNA在DSB修复中的作用已得到广泛认可，仍有许多重要问题有待解决。真核基因的结构特征深刻影响RNA在修复中的潜在作用。在人类等高等真核生物中，内含子占典型基因序列的90-95%，而外显子仅占5-10%。这种动态RNA景观如何通过形成RNA:DNA杂交体或提供RNA模板来影响修复结果，可能取决于DSB相对于外显子、内含子或剪接区域的位置。

值得注意的是，即使是端粒等重复基因组区域也会发生转录，产生可能影响这些脆弱位点修复的RNA。理解RNA在重复DNA、异染色质和其他难以修复区域的修复功能，对于绘制RNA对基因组稳定性贡献的全景图至关重要。

技术限制也是当前研究面临的重要挑战。由于某些RNA驱动的修复过程在断裂诱导后迅速发生，传统的检测方法可能无法准确捕捉RNA依赖性机制的初始贡献。未来研究需要开发更高时间分辨率的检测方法，整合新生转录分析技术，并改进活细胞成像方法，以区分RNA驱动的修复与后期或次级过程。

关键科学问题包括：什么因素决定RNA在DSB处作为结构分子还是模板分子？剪接如何影响RNA引导修复的序列特异性？RNA介导的机制在重复和异染色质区域的修复中贡献程度如何？这些过程在不同细胞类型和状态中如何调控？解决这些问题不仅将深化我们对基因组生物学的理解，还可能推动新型RNA引导的基因组工程和治疗策略的发展。

RNA在DNA双链断裂修复中的多层作用机制研究正以前所未有的速度推进，从基础分子机制到临床应用探索，这一领域将继续为生命科学和医学研究提供新的视角和机遇。随着技术方法的不断创新和理论体系的日益完善，RNA在基因组稳定性维持和基因编辑领域的核心地位将得到进一步确立。