不同抗抑郁药疗效对重度抑郁症患者肠道微生物群的影响的宏基因组分析：一项前瞻性队列研究

《Journal of Affective Disorders》：Metagenomic analysis of the gut microbiota in major depressive disorder with different antidepressant efficacy: A prospective cohort study

本研究通过单细胞转录组和蛋白质组学分析，揭示了SPINK1在胆管癌（ICC）中通过分泌CCL20招募脂质相关巨噬细胞（LAMs），形成依赖谷氨酰胺代谢的恶性微环境，并发现高SPINK1表达与患者不良预后显著相关。

　　内脏胆管癌（ICC）是一种高度异质性、侵袭性强且预后较差的恶性肿瘤，目前治疗选择有限。研究者们发现，ICC的肿瘤微环境（TME）的复杂性和持续演变是导致其不良预后的重要原因。因此，深入理解ICC的TME变化对于识别潜在治疗靶点和改善患者预后至关重要。本文通过整合多组学方法，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、蛋白质组学分析、共培养系统和功能扰动实验，探讨了ICC中上皮细胞与巨噬细胞之间的相互作用及代谢动态。研究结果揭示了一种新的SPINK1-CCL20-LAMs轴，该轴通过调控免疫细胞招募和代谢重编程在ICC中起关键作用。

研究团队首先对来自三位ICC患者的肿瘤组织和相邻正常组织进行了scRNA-seq分析，构建了转录组图谱。经过严格的质量控制筛选，共保留了22,245个高质量的细胞转录组数据，其中包括14,139个肿瘤组织细胞和8,106个相邻正常组织细胞。为了消除批次效应并实现跨样本的整合分析，研究者采用经典相关分析（CCA）方法。结果显示，ICC组织和正常组织的细胞群体在整合后能够均匀混合，表明批次效应已被有效消除。此外，研究者还对不同的细胞类型进行了注释，包括T细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、肥大细胞、髓样细胞、内皮细胞、上皮细胞、B细胞和浆细胞等。

通过比较肿瘤组织和正常组织中这些细胞类型的分布，研究发现肿瘤组织中T细胞、中性粒细胞、髓样细胞和上皮细胞的浸润显著增加。而细胞类型比例在相同组织类型的患者中保持一致，但肿瘤组织和相邻正常组织之间存在显著的异质性。这表明ICC的发展可能涉及不同的发育轨迹和微环境适应机制。进一步的基因表达差异分析揭示了与癌症进展相关的基因显著上调，如CXCL8，而与免疫激活相关的基因则显著下调，如C7。GO和KEGG富集分析进一步表明，肿瘤组织中富集了如“程序性细胞死亡的负调控”、“凋亡过程的负调控”以及“Th1和Th2细胞分化”等生物学过程，提示ICC肿瘤细胞可能通过抑制免疫介导的细胞死亡和调控T细胞分化来维持肿瘤的持续性。

在上皮细胞群体中，研究者通过特定的分子标记识别出七个不同的簇，其中E4_SPINK1簇显示出最高的拷贝数变异（CNV）评分，表明其具有显著的恶性特征。此外，E4_SPINK1簇的高表达与患者的不良预后密切相关，提示其在ICC发展中的重要性。研究者还利用CIBERSORTx算法分析了多个公共数据集，验证了E4_SPINK1在ICC患者中的高表达与较差的总生存率和无病生存率之间的关联。通过伪时间轨迹分析，研究者进一步揭示了E4_SPINK1在肿瘤细胞进化中的关键作用，其作为恶性上皮状态的终点，可能驱动ICC的进展。

研究还发现，LAMs（脂质相关巨噬细胞）在ICC组织中高度富集，其高表达的基因如APOE和APOC1表明其在脂质代谢方面具有显著特征。与正常组织中的代谢模式相比，ICC组织中LAMs表现出更强的脂质代谢倾向。此外，LAMs通过分泌CCL20促进E4_SPINK1的招募，这一过程在CCL20中和抗体处理后被逆转。研究者通过共培养实验进一步验证了这一发现，表明LAMs能够通过增加ICC细胞内的谷氨酰胺水平来促进其增殖。当SPINK1表达被干扰或谷氨酰胺转运被抑制时，这种代谢支持效应被消除，表明SPINK1在调控ICC细胞代谢方面起关键作用。

研究还发现，SPINK1的高表达与ICC患者的不良预后密切相关。通过Kaplan-Meier生存分析，研究者发现SPINK1高表达的ICC患者总生存率和无病生存率显著降低。这表明SPINK1可能作为ICC的预后标志物。此外，SPINK1的高表达在晚期ICC患者中更为显著，而E3_ITIH2簇则在早期ICC中占主导地位，这可能与SPINK1在抑制趋化因子产生、维持上皮结构和抑制IL-8表达中的作用有关。

研究团队还通过动物实验进一步验证了SPINK1在ICC中的作用。在裸鼠模型中，SPINK1沉默显著抑制了肿瘤生长和肺转移的发生，表明其在肿瘤进展中的关键作用。此外，研究者通过蛋白质组学分析和免疫组织化学（IHC）实验，确认了SPINK1在ICC组织中的高表达，进一步支持其作为治疗靶点的潜力。

研究还揭示了SPINK1与LAMs之间的相互作用。通过CellPhoneDB分析，研究者发现SPINK1与LAM_SPP1之间的相互作用最强，其中APP-CD74被鉴定为关键的配体-受体对。这一发现提示ICC可能通过APP-CD74轴抑制巨噬细胞的吞噬作用，从而促进肿瘤进展。此外，研究者还发现SPINK1与LAMs之间的CCL20分泌是其招募机制的核心，这一过程在CCL20中和抗体处理后被阻断，进一步验证了其作用机制。

在代谢方面，研究者通过scMetabolism分析发现，ICC组织中LAMs的代谢特征以脂质代谢为主，而正常组织则以氨基酸和糖代谢为主。这一代谢重编程可能支持ICC细胞的快速增殖和侵袭能力。此外，研究者发现LAMs通过高表达GLUL（谷氨酰胺合成酶）促进谷氨酰胺的合成，并将其转移给E4_SPINK1细胞，以满足其代谢需求。E4_SPINK1则通过上调SLC1A5（谷氨酰胺转运蛋白）增强谷氨酰胺的摄取，从而维持其恶性表型。这一双向代谢协同作用为ICC的治疗提供了新的思路，即通过靶向谷氨酰胺转运或合成途径来干预肿瘤进展。

综上所述，本研究通过多组学整合方法，揭示了SPINK1在ICC中的关键作用，包括其在免疫细胞招募、代谢重编程和肿瘤进展中的调控作用。研究结果不仅加深了对ICC分子机制的理解，还为开发新的治疗策略提供了理论依据。未来，研究团队计划进一步扩大样本规模，进行多中心、前瞻性研究，以验证SPINK1在临床中的应用价值。同时，研究者还将探索其他与不良预后相关的分子机制，如ATP1A1和CP的功能，以及SPINK1与其他关键配体-受体对的潜在治疗靶点。这些发现为ICC的精准治疗提供了新的方向，有望推动相关研究和临床实践的发展。