《Journal of Molecular Structure》：Integrating
in silico and
in vitro Approaches for the Development of Chloropyrazole-Based InhA Inhibitors with Potent Anti-Tubercular Activity
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结核分枝杆菌InhA酶抑制剂的理性设计、分子对接及动态模拟研究，合成25个氯吡唑啉衍生物，发现KR5具有最高抑制活性（MIC=1.6 μg/mL）和最低毒性（细胞毒性≤100 μg/mL），其高选择性（SI>62.5）和稳定构象为新型抗结核药物开发奠定基础。
Kunal G. Raut | Anuruddha R. Chabukswar | Priyanka S. Waghmare | Swati C. Jagdale | Pooja T. Giri
印度浦那411038，Vishwanath Karad MIT世界和平大学健康科学与技术学院药学科学系。
摘要
结核病（TB）仍然是一个重大的全球健康负担，而耐药性Mycobacterium tuberculosis菌株的出现使这一问题更加严重，因此需要开发新的化疗药物。在这项研究中，设计、合成并评估了一系列基于氯吡唑的衍生物，作为烯酰-酰基载体蛋白还原酶（InhA）的潜在抑制剂，该酶是麦角酸生物合成途径中的一个已知靶点。通过基于结构的分子对接研究（使用共结晶的羧酰胺配体PDB ID: 4TZK进行重新对接验证），确定了KR4和KR5是具有良好结合能和在InhA活性位点内关键相互作用的有希望的候选分子。分子动力学模拟结合主成分分析（PCA）、动态互相关矩阵（DCCM）和自由能景观（FEL）分析证实了这些复合物的稳定性，其中KR5表现出较高的构象刚性，而KR4则显示出中等灵活性。使用微孔板Alamar Blue测定法（MABA）进行的生物评估显示，KR5具有最强的抗结核活性（MIC = 1.6 μg/mL），与异烟肼相当；KR1和KR4也显示出显著的活性（MIC = 3.12 μg/mL）。重要的是，对Vero细胞的细胞毒性研究表明，KR1、KR4和KR5在100 μg/mL浓度下均无毒性，这突显了它们的优异安全性。选择性指数（SI）进一步强调了它们的治疗安全边际，KR1和KR4的SI > 32.05，而KR5的SI > 62.5，与异烟肼相当，证明了它们对Mycobacterium tuberculosis的高度选择性。此外，体外InhA酶抑制实验验证了计算预测的结果，KR5的抑制作用与异烟肼相当，证实了其与目标酶的直接生化相互作用。这种综合的计算-实验方法表明，基于氯吡唑的衍生物，特别是KR5，是很有前景的针对InhA的抗结核候选药物。
引言
结核病（TB）是全球主要的死亡原因之一。由于它通过空气传播，任何人都可能被感染，但生活在高发病率地区的人们面临更大的风险[1]。2023年，结核病导致全球125万人死亡，再次成为主要的传染病杀手。全球有1080万人受到影响[2,3]。多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）结核菌株的日益普遍严重阻碍了治疗工作[4]。目前的一线药物，包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇，对敏感型结核病有效，但其长期治疗、相关毒性以及耐药性的增加凸显了开发新型有效抗结核药物的重要性[5]。
烯酰-酰基载体蛋白还原酶（InhA）在Mycobacterium tuberculosis的II型脂肪酸合成（FAS-II）途径中起着关键作用，这是细菌细胞壁的主要成分——麦角酸生物合成所必需的[6,7]。作为一种依赖NADH的酶，InhA催化脂肪酸延长的最后一步还原反应[[8], [9], [10]]。InhA的临床重要性在于它是异烟肼（INH）这一一线抗结核药物的主要靶点[11]。然而，由于负责INH激活的KatG酶发生突变，导致了直接抑制InhA的抑制剂的发展，从而绕过了这一激活步骤。直接靶向InhA为对抗耐药性结核病提供了有希望的策略，并可以在保持疗效的同时缩短治疗时间。
基于唑类的杂环化合物具有显著的药代动力学特性和亲脂性，有助于药物穿过细胞膜并到达靶点。它们还通过抑制脂质生物合成表现出对抗耐药性结核病的潜力[12]。在杂环化合物中，吡唑衍生物受到特别关注，因为它们具有多种药理活性，包括抗炎[13,14]、镇痛[15,16]、抗癌[17,18]、抗病毒[19]和抗菌作用[20]。先前的研究也报道了几种具有强InhA抑制活性和对M. tuberculosis H37Rv具有良好最低抑制浓度（MIC）值的吡唑衍生物，如图1所示。
设计这些分子系列的理由是将吡唑核心与取代的苯乙酰胺基团结合，这一设计基于之前报道的InhA抑制剂的结构特征。选择吡唑核作为中心药效团，因为它在增强InhA活性位点内的氢键、π–π堆叠和疏水相互作用方面已被证明有效。此外，在吡唑的N-1位置引入乙酰胺连接基团提供了构象灵活性，并使其能够最佳地与InhA结合口袋中的催化残基Tyr158、Met103和Ile215相互作用。
在苯环上引入吸电子和供电子取代基是为了调节亲脂性和电子分布，从而影响酶的亲和力和细胞通透性。假设吡唑环上的4-氯-3,5-二甲基取代模式可以增强疏水接触并提高代谢稳定性，这与类似骨架的先前SAR研究结果一致。因此，设计2-(4-氯-3,5-二甲基-1H-吡唑-1-yl)-N-取代-苯乙酰胺衍生物的目的是为了实现对InhA的更好结合亲和力和对Mycobacterium tuberculosis H37Rv菌株的强体外抗结核活性。
在本研究中，我们设计并合成了一系列2-(4-氯-3,5-二甲基-1H-吡唑-1-yl)-N-取代-苯乙酰胺衍生物，作为潜在的InhA抑制剂用于治疗结核病。通过分子对接研究了合成化合物与InhA酶之间的结合相互作用。为了进一步验证最有希望的配体-蛋白质复合物的稳定性和动力学，进行了分子动力学（MD）模拟，并使用MM-GBSA方法估算了结合自由能。此外，还评估了所有合成化合物对Mycobacterium tuberculosis H37Rv菌株的体外抗结核活性。
部分摘录
分子对接
使用Biovia Discovery Studio (DS) 2024软件进行了分子对接研究，以研究配体与目标蛋白之间的相互作用。
结果与讨论
作为合理药物设计策略的一部分，基于吡唑的衍生物（KR1-KR25）的设计主要基于InhA酶活性位点的结构特征（PDB ID: 4TZK）。选择吡唑作为核心是因为其多样的药理活性以及在抗菌剂中的公认作用。引入了多种苯胺基取代基，以探索取代吡唑衍生物的结构-活性关系。
结论
在这项研究中，采用综合的计算-生物学方法设计、合成并评估了新型基于氯吡唑的衍生物作为潜在的针对InhA的抗结核药物。对接和重新对接实验证实了可靠的结合预测，KR4和KR5显示出强烈的亲和力（–CDOCKER相互作用能：37.249和36.748 kcal/mol）以及与InhA抑制相关的关键相互作用。
数据可用性
数据将根据请求提供。
CRediT作者贡献声明
Kunal G. Raut：撰写——原始草稿、软件、方法学、概念构思。
Anuruddha R. Chabukswar：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理。
Priyanka S. Waghmare：研究、数据管理。
Swati C. Jagdale：撰写——审阅与编辑、监督、数据分析。
Pooja T. Giri：研究、数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务或个人关系可能会不恰当地影响或被认为会影响本手稿中报告的工作。
致谢
作者衷心感谢Vishwanath Karad MIT世界和平大学管理层提供的支持和基础设施，这极大地促进了本工作的完成。
