探究柠檬酸 Lime 蔬果皮精油对多重耐药志贺菌的抗菌及生物膜抑制作用：体外与计算机模拟研究

《Letters in Drug Design & Discovery》：Exploring the antimicrobial and biofilm inhibitory potential of Citrus limetta peel essential oil against multidrug-resistant Shigella: In vitro and in silico insights

甜橙皮精油通过GC-MS鉴定含25种成分，以D-柠檬烯（83.91%）为主，对多重耐药志贺氏菌（S. sonnei）和酸性条件下的分枝杆菌（M. smegmatis）表现出显著抗菌活性（IC50分别为31.64和30.92 mg/mL），并通过分子对接和动态模拟验证了tyranton与Shigella OspG蛋白的高效结合（-4.891 kcal/mol）。

　　### 解读：甜橙皮精油在抗菌和抗生物膜方面的潜力研究

#### 引言：抗菌耐药性的全球挑战与植物来源的解决方案

随着全球范围内抗菌耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）的迅速上升，传统抗生素的有效性正面临严峻挑战。这一现象在临床和农业环境中尤为严重，因抗生素的过度使用和滥用，导致耐药菌株的快速繁殖和传播。抗菌耐药性不仅威胁人类健康，还显著增加了感染治疗的难度，使患者面临更长的住院时间、更高的医疗成本以及更高的死亡率。因此，寻找替代性的抗菌治疗策略成为当前研究的重要方向。

植物源性物质，尤其是精油，因其丰富的生物活性成分而受到广泛关注。精油是从植物中提取的挥发性化合物混合物，其独特的化学组成赋予了它多种生物活性，包括抗菌、抗炎、抗氧化等。这些特性使其成为对抗抗菌耐药性病原体的潜在候选药物。近年来，越来越多的研究聚焦于植物精油的抗菌潜力，特别是针对那些传统抗生素难以治疗的耐药菌株。

在这一背景下，甜橙（*Citrus limetta*）因其果皮中富含精油而受到关注。尽管甜橙的果肉广受欢迎，但其果皮通常被当作农业废弃物处理。然而，果皮中所含的精油不仅具有丰富的化学成分，还可能蕴含多种生物活性，具备开发为抗菌药物的潜力。本研究正是基于这一前提，旨在评估甜橙果皮精油的抗菌和抗生物膜能力，并探索其在治疗抗菌耐药性细菌中的应用前景。

#### 材料与方法：实验设计与技术手段

本研究采用了多种实验方法，包括传统的*in vitro*实验和现代的*in silico*计算方法，以全面评估甜橙果皮精油的抗菌和抗生物膜特性。

首先，通过植物材料的采集与提取，获得了甜橙果皮精油。新鲜果皮从印度巴蒂纳（Bathinda）的本地市场采集，并在实验室条件下进行处理。采用水蒸气蒸馏法（Hydrodistillation）提取精油，这一方法能够有效分离出果皮中的挥发性成分。提取后的精油通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行化学成分分析，以确定其主要成分及其相对含量。

随后，对精油的抗菌活性进行了评估。采用微量肉汤稀释法（Microbroth Dilution Assay）测定精油对不同细菌的最小抑菌浓度（MIC）。测试的细菌包括革兰氏阳性菌（如*Bacillus subtilis*）、革兰氏阴性菌（如*Shigella sonnei*、*Salmonella enterica*、*Escherichia coli*）以及抗酸菌（如*Mycobacterium smegmatis*）。通过比较不同浓度精油对细菌生长的抑制效果，可以确定其抗菌能力。

为了评估精油对生物膜的抑制作用，采用了结晶紫（Crystal Violet, CV）染色法。生物膜是细菌在特定环境中形成的一种复杂结构，能够显著增强其对环境压力的耐受性，使得传统的抗菌方法难以有效清除。因此，本研究特别关注精油对多药耐药性（Multidrug-Resistant, MDR）*Shigella*菌株生物膜形成的影响。

此外，本研究还结合了计算机模拟技术，如分子对接（Molecular Docking）和分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟，以进一步探究精油成分与目标蛋白（如*Shigella* effector kinase OspG）之间的相互作用。这些计算方法能够提供关于化合物与蛋白结合能力的详细信息，包括结合亲和力和稳定性的预测，从而为后续实验提供理论支持。

#### 实验结果与分析：精油的抗菌与抗生物膜能力

GC-MS分析结果显示，甜橙果皮精油中含有25种不同的化合物，其中*D*-柠檬烯（D-Limonene）是主要成分，占精油总含量的83.91%。此外，还检测到了其他重要成分，如芳樟醇（Linalool）、β-蒎烯（β-Pinene）等。这些化合物可能共同作用，增强精油的抗菌效果。

在抗菌活性测试中，精油表现出对*Mycobacterium smegmatis*和*Shigella sonnei*较强的抑制作用，其IC??值分别为30.92 mg/mL和31.64 mg/mL。相比之下，*Salmonella enterica*和*Bacillus subtilis*对精油表现出较高的耐药性，其IC??值均超过800 mg/mL。这一结果可能与这些细菌的细胞结构和耐药机制有关，例如，*Salmonella*的外膜屏障和*Bacillus subtilis*的孢子形成能力，可能降低了精油对其的抗菌效果。

在抗生物膜测试中，精油对MDR *Shigella*菌株的生物膜形成表现出显著的抑制作用，其IC??值为83.27 mg/mL。这一结果表明，精油在抑制生物膜形成方面具有一定的潜力，但所需的浓度较高，可能限制了其在体内的系统性应用。然而，考虑到生物膜结构的复杂性，精油可能在局部应用或特定药物配方中展现出更有效的抗菌效果。

分子对接和分子动力学模拟进一步揭示了精油成分与OspG蛋白之间的相互作用。其中，tyranton显示出最强的结合亲和力，其结合能为-4.891 kcal/mol，显著高于参考药物环丙沙星（Ciprofloxacin）的-3.824 kcal/mol。这一结果表明，tyranton可能是精油中对抗*Shigella*的关键成分之一。MD模拟结果显示，tyranton与OspG蛋白的结合稳定，且其在模拟过程中表现出较低的RMSD值，表明其在结合位点中的构象变化较小，具有较强的稳定性。

此外，对精油成分的ADMET（吸收、分布、代谢、排泄、毒性）特性进行了评估。结果显示，所有25种成分均符合药物样性（drug-likeness）的标准，表明其在体内具有良好的生物利用度和安全性。其中，部分成分显示出较高的皮肤渗透性，这为其在局部应用中的潜力提供了支持。同时，一些成分表现出良好的脑部渗透性，可能在神经系统相关疾病的治疗中具有应用前景。

#### 讨论：精油成分的协同作用与应用前景

尽管*D*-柠檬烯是甜橙果皮精油的主要成分，但其抗菌活性可能并不完全依赖于单一成分，而是多种成分之间的协同作用。例如，tyranton虽然在精油中的含量较低，但其较强的结合亲和力和稳定性可能在抗菌过程中起到关键作用。这种协同效应使得精油在对抗耐药菌株时表现出更全面的抗菌能力。

从实际应用的角度来看，精油的抗菌和抗生物膜特性可能在多个领域具有重要价值。首先，在农业和食品工业中，精油可以作为一种天然的抗菌剂，用于食品保鲜和病原菌控制。其次，在医疗领域，精油可能被开发为新型抗菌药物，特别是在对抗多药耐药性细菌时，其可能提供一种有效的替代方案。此外，精油的抗生物膜特性使其在治疗慢性感染和生物膜相关疾病（如牙周炎、慢性伤口感染等）中具有潜在的应用价值。

然而，精油在系统性应用中的局限性也不容忽视。由于其IC??值较高，可能需要通过药物配方的优化（如纳米封装、联合用药等）来提高其在体内的生物利用度和抗菌效果。此外，进一步的*in vivo*研究和临床试验是必要的，以验证精油在实际应用中的有效性和安全性。

#### 结论：植物精油的抗菌潜力与未来研究方向

本研究结果表明，甜橙果皮精油在抗菌和抗生物膜方面展现出显著的潜力，尤其是在对抗多药耐药性细菌和抗酸菌方面。GC-MS分析、*in vitro*抗菌实验和*in silico*模拟均支持这一结论。尽管精油在系统性应用中可能面临一定的挑战，但其在局部治疗和药物配方优化中的应用前景广阔。

未来的研究应进一步探索精油成分的药理机制，特别是其与细菌靶点（如OspG蛋白）之间的具体相互作用。此外，还需要进行更多的*in vivo*实验，以评估精油在实际治疗中的效果和安全性。同时，开发更有效的药物配方和联合治疗策略，可能有助于提高精油的抗菌效率，从而拓宽其在抗菌治疗中的应用范围。

本研究的结果为植物源性抗菌药物的开发提供了重要的理论依据和实验支持，同时也为应对全球抗菌耐药性问题提供了新的思路和方向。甜橙果皮精油作为一种天然资源，其在抗菌和抗生物膜方面的潜力值得进一步深入研究和应用。