加拿大西部北极地区高地苔原与多边形苔原中甲烷氧化菌群落的差异及其与氮代谢和甲烷吸收的关联

《Soil Advances》：Contrasting methanotrophic communities between upland and polygonal tundra and their link to nitrogen metabolism and methane uptake in the Western Canadian Arctic

北极冻土带甲烷氧化机制及氮循环关联研究。在加拿大西北部苔原区，通过靶向宏基因组学分析发现土壤pH是调控甲烷氧化基因（pmoA、mmoX）分布的主因：岗地苔原（pH 5-7）以USCγ菌群为主，平均甲烷吸收率-27 μg CH4-C m-2 h-1；polygons苔原（pH 5）以USCα菌群为主，吸收率-19 μg CH4-C m-2 h-1。氮循环过程存在显著差异：岗地苔原以反硝化（nirK、nrfA基因丰度较高）为主，polygons苔原依赖生物固氮（nifH基因丰度较高）。研究证实环境因子（pH、水分）与微生物功能基因（mmoX多样性R=0.007，p=0.007）共同驱动甲烷吸收，为冻土区甲烷汇模型提供新参数。

　　北极地区土壤对大气甲烷（CH?）的吸收在干苔原生态系统中普遍存在。然而，目前对于控制这种吸收过程的环境因素了解有限，特别是土壤营养物质的可利用性或微生物群落组成。本研究采用一种针对性的宏基因组学方法，分析了两种不同的苔原类型（加拿大西部北极地区的多边形苔原和高地苔原）中与CH?和矿物氮（N）循环相关的功能基因标记的相对丰度和群落结构。研究还比较了土壤特性、宏量和微量元素浓度以及整个生长季（5月至8月）期间的CH?通量。研究发现，土壤pH值是控制基因分布的最重要因素。在多边形苔原（低pH值）中，与高地土壤簇α（USCα）相关的甲烷氧化菌占主导地位，而在高地苔原（高pH值）中，USCγ菌则更为常见。CH?吸收速率范围从-15到-27 μg CH?–C m?2 h?1（生长季平均值），并随着USCα和USCγ的相对丰度增加而上升。尽管两种微生境的CH?吸收速率相似，但我们的微生物数据表明，这些营养受限的苔原环境中存在不同的机制来应对氮限制：高地苔原以涉及反硝化和氮保留的基因为特征，而多边形苔原则包含与生物固氮相关的基因。这项研究强调了在北极苔原土壤中，对甲烷氧化菌与氮可用性之间的相互作用需要进行综合研究。

甲烷氧化是一个重要的机制，不仅在湿地中，而且在较干燥的高地土壤中也发挥着作用。然而，高和低CH?排放环境中的微生物群落组成和功能，以及CH?的来源，存在显著差异。CH?的来源是来自湿地土壤的生产还是大气，具有气候意义：在湿地中，甲烷生成导致水饱和土壤层中CH?浓度较高，低亲和力的甲烷氧化菌会在其到达大气之前氧化大量产生的CH?，从而作为“生物过滤器”减少湿地CH?排放高达10-90%。而在排水良好的土壤中，甲烷氧化主要由高亲和力的甲烷氧化菌调节，这些菌在接近环境（即大气）CH?浓度（约1.9 ppm）下运作。高亲和力的甲烷氧化菌通过有氧呼吸利用CH?作为碳（C）和能量来源，能够从大气中去除CH?，从而使生态系统成为CH?的净吸收源。高和低亲和力的CH?氧化均受已知的非生物驱动因素影响，如土壤结构和湿度（调控土壤空气填充孔隙和氧和CH?的扩散）、温度（调控微生物过程的速率）以及pH值。

高亲和力甲烷氧化菌能够利用大气中的CH?（Tveit等，2019；Schmider等，2024），使它们成为气候变化背景下的重要参与者，尤其是在物质受限的环境，如苔原生态系统中（Ji等，2017；Greening和Grinter，2022）。一些研究报告称，在贫瘠、岩石和植被稀疏的区域，最大的CH?吸收速率发生（D’Imperio等，2017；Hermesdorf等，2022；Juutinen等，2022）。其他研究则指出甲烷氧化活性与氮化合物之间的密切联系，包括氮的刺激和抑制效应（Bodelier和Laanbroek，2004；Lau等，2007）。虽然甲烷氧化菌需要可利用的氮，尤其是氨，以维持其代谢（Kuypers等，2018），但推断生态系统氮可用性与CH?氧化之间的紧密联系，这一联系在北极环境中仍然研究不足。

除了碳和氮的可用性，其他微量元素如硫酸盐（SO?2?）、铁（Fe）和铜（Cu）也可能起作用（Sirajuddin和Rosenzweig，2015；Gwak等，2022；Hu等，2024）。特别是铜，作为有氧CH?氧化的关键元素，因为它调节甲烷氧化菌中的酶活性（Semrau等，2010；Fru，2011）。综上所述，先前的研究表明，除了非生物驱动因素外，可溶性碳源和宏量（如氮）及微量元素（如铜、铁）的可用性可能调控有氧CH?氧化。

CH?氧化的关键酶是甲烷单加氧酶（MMO），它通过甲醇和其他中间产物将CH?氧化为CO?。两种类型的MMO，分别由两种不同的基因编码：颗粒型、膜结合型的pMMO和可溶型的sMMO。与甲烷氧化相关的两种功能基因标记，pmoA和mmoX，分别编码pMMO的β亚基和sMMO的α亚基。在所有甲烷生成者中，CH?生成的最常用功能基因标记是mcrA，它编码甲基辅酶M还原酶（MCR）的α亚基（MCR的活性亚基）。除了甲烷氧化菌，其他微生物群如氨氧化细菌也能消耗CH?（Jones和Morita，1983；Bédard和Knowles，1989；Bodelier和Laanbroek，2004）。氨单加氧酶（AMO）的α亚基，由amoA基因编码，与MMO在结构和代谢上相似，并且对CH?和氨都有亲和力。AMO介导了氨氧化，这是硝化作用的第一步。氮的可用性，通常在苔原和针叶林环境中有限（Sistla等，2012；H?gberg等，2017），但对CH?氧化具有高度相关性，受到多种氮循环过程的调控（Butterbach-Bahl等，2013）。这些氮循环过程包括生物固氮（BNF）、硝酸盐还原为铵（DNRA）、厌氧氨氧化（Anammox）以及反硝化作用。因此，为了探索CH?循环的复杂性，包括其与氮循环的可能相互作用，除了研究与甲烷氧化相关的pmoA和mmoX功能基因标记外，还应研究更广泛的C和N相关基因（Kuypers等，2018）。

尽管霰弹式宏基因组学能提供微生物群落组成的总体信息，但它可能无法提供足够的测序深度，以可靠地检测低丰度的功能性微生物群，如甲烷氧化菌、甲烷生成古菌或参与矿物氮循环的微生物。此外，扩增子测序可能因使用的引物而产生偏差，如果需要对大量基因进行测序，可能需要多个引物对，这使过程变得繁琐。为了克服这些限制，我们应用了一种针对性的测序方法，通过探针捕获（Manoharan等，2015；Putkinen等，2021；Siljanen等，2022），针对六种苔原微生境中的15个功能基因标记。我们结合这些微生物分析，与详细的现场CH?通量和土壤剖面气体浓度测量、土壤宏观和微量元素可用性以及土壤物理化学性质进行综合研究。我们的大多数微生境位于高中心多边形苔原，具有不同的湿度状况，以及高地苔原，这些微生境相对干燥，预计会作为CH?的吸收源或小排放源。

我们的研究目标是开发CH?通量的替代指标，特别是大气CH?的吸收，并探索CH?氧化与氮循环之间的联系。为此，我们对这些广泛的苔原地表类型中的CH?和氮循环社区及营养状况进行了特征分析。具体而言，我们的目标是将CH?吸收与营养可用性、环境条件和微生物基因丰度（相对于目标基因）联系起来，并评估这些变量在形成苔原土壤净CH?吸收中的重要性。我们假设湿度是CH?通量和微生物功能基因丰度空间变化的主要控制因素，并且甲烷氧化菌，特别是那些与高亲和力CH?氧化相关的菌群，可以与CH?吸收的大小相关。最重要的是，我们预期氮循环微生物的丰度与甲烷氧化菌相关，从而提供关于研究地点甲烷氧化菌氮限制和氮需求的见解。考虑到北极温室气体报告中非湿地地点的明显代表性不足，了解CH?通量的驱动因素对于改进数据驱动的扩展和基于过程的模型以预测北极碳预算至关重要。

在本研究中，我们采用了针对甲烷氧化和氮循环的功能基因标记进行测序，包括pmoA、mmoX、mcrA、amoA、TamoA、nxrB、nirK、nirS、norB、nosZ、nrfA、nirB等。通过这种方法，我们能够识别出与这些功能相关的微生物群，并确定其在不同微生境中的分布模式。我们利用RDA分析来识别功能基因丰度与CH?通量、土壤剖面气体浓度、土壤特性、营养物质和环境变量之间的关系。变量在分析前使用z-score缩放进行处理，以减少变量数量。在RDA中，排除了基因丰度极低（平均 < 0.1%）或功能重复（如nir）的基因，以及浓度接近零的营养物质。如果离子通过PRS探针和IC分析同时测定，仅保留PRS探针的数据。此外，在RDA前排除了高度相关的变量（Spearman相关系数 > 0.75）。植物可利用的氮（NO??和NH??）被汇总为总矿物氮（Nmin）。逐步模型选择确定了pH和VWC用于构建最佳模型（调整R2 = 0.32）。这两个变量（pH和VWC）通过前向变量选择被确认为统计显著（α = 0.05），其p值分别为0.001（pH）和0.003（VWC）。我们围绕这两个变量（基因 ~ VWC + pH）约束了基因矩阵。该模型解释了38%的变异，并在统计上显著（ANOVA分析，p = 0.001），两个轴均显著（RDA1 p值 = 0.001，RDA2 p值 = 0.006）。方差膨胀因子（VIF）被用来识别高度相关的变量，这两个选定的变量几乎没有多重共线性（VIF < 2）。最终的RDA图包括所有与轴显著相关的变量（表S1），并使用R包vegan中的envfit函数进行相关性分析。

土壤剖面气体浓度和CH?通量显示出明显的季节变化（图1）。在表现出净CH?吸收的地点，土壤剖面CH?浓度通常低于大气浓度（约1.9-2.0 ppm），范围从1.35-2.08 ppm（Lichen）、1.76-2.07 ppm（Shrub）和1.41-2.21 ppm（Polygon Rim）。通常，最低的低于环境浓度发生在10-20厘米深度。在同一深度，我们观察到较高的CH?浓度，表明在表现出净CH?排放的微生境和时期中存在活跃的CH?生成。在Thermokarst湿地（图S2）以及Polygon Center的20厘米深度中，观察到高达数千ppm的CH?浓度。值得注意的是，Polygon Center中仅有一小部分生成的CH?被排放到大气中。Thermokarst湿地在整个测量期间表现出显著的CH?释放（图S2），而Tussock在8月中旬也表现出净CH?排放。相比之下，Polygon Center没有显示出大量的CH?释放（图1B）。Shrub、Lichen和Polygon Rim在整个春季和生长季中都是持续的CH?吸收源，其平均吸收速率为-15、-19和-27 μg CH?–C m?2 h?1（表1）。在研究的微生境中，最大CH?吸收速率达到-56±27 μg CH?–C m?2 h?1（Shrub，DOY 194）、-39±0.24 μg CH?–C m?2 h?1（Lichen，DOY 198）和-59±26 μg CH?–C m?2 h?1（Polygon Rim，DOY 242）（图1B）。Tussock、Polygon Center和Polygon Trough的通量在7月中旬前波动，介于小净吸收和排放之间。在7月中旬后，这些微生境转变为CH?的来源。尽管这些微生境暴露在相同的环境条件下，如气温和降雨，但CH?吸收的高峰以及CH?排放最大的时期在高地苔原和多边形苔原之间有所不同：Polygon Rim和Polygon Trough的CH?吸收高峰持续时间较长，而高地苔原的吸收高峰则在7月初。高地苔原的CH?排放高峰出现在8月中旬，而多边形苔原的排放高峰出现在7月中旬。Thermokarst湿地是最大的CH?来源，整个测量期间以3632±2618 μg CH?–C m?2 h?1的速率排放CH?（图S2）。

我们的研究结果表明，土壤pH值是控制基因分布的最重要因素，而土壤湿度则是次要驱动因素，这与我们的假设相反。与USCα和USCγ相关的微生物被认为在高地草甸和森林土壤中主导了大气CH?的氧化（Knief，2005；Deng等，2019）。USCγ似乎在接近中性的土壤pH值下占主导地位，而USCα则常见于酸性土壤（Kolb，2009）。我们的研究以及少数其他基于北极的研究似乎证实了USCα和USCγ在北极苔原生态系统中的pH依赖性主导（Martineau等，2014；D’Imperio等，2023）。通常，只有USCα被发现（Lau等，2015；Singleton等，2018；Belova等，2020），这可能是因为研究的北极苔原生态系统中酸性条件的存在。USCα和USCγ类群中的微生物可能通过不同的策略适应不同的环境条件。

我们观察到在高地和多边形苔原中，基因与其相应功能之间的显著差异（图3，图4）。与厌氧硝酸盐还原途径相关的基因（如nirK、nirS、norB、nosZ）在高地苔原中相对更丰富，而与生物固氮相关的基因（如nifH）在多边形苔原中更为丰富。此外，高地和多边形苔原在pmoA基因中表现出不同的甲烷氧化菌类型：在两个地点中，甲烷氧化菌群落均以USC为主导，但USCγ在高地苔原中占主导地位，而USCα在多边形苔原中更为丰富。甲烷氧化菌群落的结构在高地和多边形苔原之间也有所不同，这在pmoA和mmoX基因的属水平上尤为明显（图5，图6）。在pmoA基因中，USCγ类群中的未培养甲烷氧化菌在高地苔原中占主导地位，而细菌氨氧化菌，特别是Nitrosomonas spp.，也存在（图5A）。然而，由于在研究地点存在大量的amoA基因，我们推测多边形苔原中可能也存在其他细菌氨氧化菌。在高地苔原中，与Ca. Methylomirabilis oxyfera和Methylomonas denitrificans相关的序列也显示出显著的丰度。相比之下，多边形苔原则显示出USCα类群中的高相对丰度，其中与Methylocapsa gorgona相关的序列最为丰富（图5A）。此外，Methylocystis bryophila相关的序列也丰富，还有与Methylobacter和某些其他Methylocapsa相关亚种的序列。

在研究的微生境中，我们观察到明显的差异，这些差异在基因与相应功能的关联中体现出来（图3，图4）。与厌氧硝酸盐还原途径相关的基因（如nirK、nirS、norB、nosZ）在高地苔原中相对更丰富，而与生物固氮相关的基因（如nifH）在多边形苔原中更为丰富。此外，高地和多边形苔原在pmoA基因中表现出不同的甲烷氧化菌类型：在两个地点中，甲烷氧化菌群落均以USC为主导，但USCγ在高地苔原中占主导地位，而USCα在多边形苔原中更为丰富。甲烷氧化菌群落的结构在高地和多边形苔原之间也有所不同，这在pmoA和mmoX基因的属水平上尤为明显（图5，图6）。在pmoA基因中，未培养的甲烷氧化菌（如USCγ类群）在高地苔原中占主导地位，但细菌氨氧化菌，特别是Nitrosomonas spp.，也存在。然而，由于在研究地点存在大量的amoA基因，我们推测多边形苔原中可能也存在其他细菌氨氧化菌。在高地苔原中，与Ca. Methylomirabilis oxyfera和Methylomonas denitrificans相关的序列也显示出显著的丰度。相比之下，多边形苔原则显示出USCα类群中的高相对丰度，其中与Methylocapsa gorgona相关的序列最为丰富。此外，Methylocystis bryophila相关的序列也丰富，还有与Methylobacter和某些其他Methylocapsa相关亚种的序列。

CH?通量显示出随着USCγ（高地苔原）和USCα（多边形苔原）的相对丰度增加而增加的趋势（图5C，表S2）。对于一些其他物种，如Methylococcus capsulatus，还观察到与CH?通量和土壤剖面CH?浓度的中等负相关（表S2）。在mmoX基因中，CH?氧化菌Mycobacterium goodii是两个苔原地点中最丰富的物种（图5）。我们观察到与CH?浓度的负相关性（图S6），表明在这些基因丰度较高的微生境中CH?吸收更高。此外，在图4B和图S6中，mmoX多样性显示出比相对丰度更强的与CH?通量和浓度的相关性。除了甲烷氧化菌，我们还观察到氮循环基因，特别是与内部氮循环（DNRA）和氮获取（BNF）相关的基因，与土壤CH?浓度相关（图4）。RDA分析突出了基因丰度和组成在高地和多边形苔原栖息地之间的差异：高地苔原显示出更多的氮循环和氮释放基因，以及更丰富的甲烷氧化菌群落，而多边形苔原则以甲烷氧化菌和BNF基因相对其他目标基因更为丰富（图3，图4）。

在研究的微生境中，土壤物理化学性质、宏量和微量元素可用性表现出显著差异。如预期的那样，高地和多边形苔原在土壤pH值（pH 7 vs. pH 5）、最大融化深度（60-80厘米 vs. 36-50厘米）和土壤有机层厚度（图1）上存在明显差异。在高地苔原中，有机层厚度是可变的，但Lichen的有机层最薄（平均：5.6厘米），其次是Shrub（平均：16.5厘米），而Tussock的有机层厚度高度异质（范围在0-40厘米之间）。相比之下，多边形苔原的微生境均具有较厚的有机层（>50厘米）。因此，0-10厘米土壤层中的土壤有机质和碳含量受到有机层厚度的显著影响（表1）。总氮浓度在所有地点均约为1.2%，除了Tussock和Polygon Trough，其中氮浓度最低，分别为0.9%（C/N比=20）和0.5%（C/N比=86）。总体而言，C/N比在高地苔原中最低，范围在20-22之间。在多边形苔原中，尽管土壤水分较高，但CH?排放量仍低于Tussock（图1B），并且与北极低中心多边形苔原区域的排放量相比较低（Kutzbach等，2004）。我们的发现表明，如果存在莎草，即使在较干燥的地点，也可能发生较高的CH?排放，并且CH?可能在较深的土壤层中生成。CH?通量严重依赖于土壤水分。因此，当水位低于地表且没有气孔植物时，水饱和的无氧土壤层中生成的CH?可能通过有氧土壤层的向上扩散部分或全部被氧化（Le Mer和Roger，2001；Lai，2009）。因此，尽管多边形苔原的土壤水分较高，但气孔层的存在和Sphagnum sp.的存在足以在CH?生成之前将其去除（图1）（Parmentier等，2011；Korrensalo等，2022；Jentzsch等，2024）。

尽管我们研究了不同的微生境，但CH?通量没有显示出明显的差异，这与我们的假设相悖。在这些微生境中，Lichen、Shrub和Polygon Rim在整个春季和生长季中都是持续的CH?吸收源，而Tussock是唯一的高地苔原微生境，表现出CH?排放，这表明在Tussock的深处存在活跃的CH?生成，且通过植被组织（气孔植物）将CH?输送到大气中（Joabsson和Christensen，2001；Kutzbach等，2004；Knoblauch等，2015；Korrensalo等，2022）。Tussock的CH?生成支持了其深层存在甲烷生成菌（图2A），这些菌在其他研究微生境的表层土壤中大多缺失。排放的波动贯穿整个季节，并且Tussock在7月初从一个小型吸收源或中性微生境转变为排放源（图1B）。一个可能的解释是，在莎草的根系区域，由于可溶性碳源的供应，CH?生成在生长高峰期增加，随后通过植被输送到大气中（McEwing等，2015；Ge等，2025）。然而，Tussock的排放量（0.045±0.153 mg CH?–C m?2 h?1；平均±标准差）与Thermokarst湿地（CH?热点）的排放量相比仍然较小，而Thermokarst湿地的排放量在我们的研究中达到3.6±2.6 mg CH?–C m?2 h?1（图S2），与北极-针叶林地区湿地站点的合成平均值（沼泽：1.3，湿地：2.5，沼泽：5.3 mg CH?–C m?2 h?1）相比仍然较低（Kuhn等，2021）。

Lichen和Shrub在任何季节都没有表现出CH?排放，尽管这些微生境与Tussock相邻，且在雨季或深层融化等有利的湿度条件下，仍然没有CH?生成。在多边形苔原中，与Tussock类似，Polygon Trough和Polygon Center在夏季末期出现了小的排放峰值（图1B）。土壤中可溶性碳源的耗竭（如NO??）可能在夏季末期的大多数地点导致观察到的排放峰值。在多边形苔原中，尽管土壤水分较高，但排放量仍低于Tussock（图1B），并且低于北极低中心多边形苔原区域的排放量（Kutzbach等，2004）。我们的发现表明，如果存在莎草，即使在较干燥的地点，也可能发生较高的CH?排放，并且CH?可能在较深的土壤层中生成。CH?通量严重依赖于土壤水分。因此，当水位低于地表且没有气孔植物时，水饱和的无氧土壤层中生成的CH?可能通过有氧土壤层的向上扩散部分或全部被氧化。因此，尽管多边形苔原的土壤水分较高，但气孔层的存在和Sphagnum sp.的存在足以在CH?生成之前将其去除。

CH?通量的差异可能与氮循环基因的丰度有关。尽管结果对营养相关驱动因素对基因丰度和CH?吸收的影响尚不明确，但我们的研究确实观察到了不同微生境之间氮循环基因的显著差异。与反硝化和DNRA相关的基因在高地苔原中尤为重要，而与生物固氮相关的基因在多边形苔原中更为显著。虽然传统的理解认为氮添加，特别是氨和亚硝酸盐（NO??），会抑制CH?氧化（Schnell和King，1994；Dunfield和Knowles，1995），但氮和磷的可用性可能对微生物群落产生不同的影响。此外，微生物群落通过生物固氮或DNRA等不同策略获取氮，这可能会影响CH?氧化，并导致生态系统CH?吸收动态的时空变化。

我们发现，甲烷氧化菌群落的结构在高地苔原（USCγ）和多边形苔原（USCα）之间存在显著差异，其pH值分别为7和5（图3C，图5A）。实际上，RDA分析确定土壤pH值是解释微生境间相对基因丰度变化的最重要因素，而土壤湿度则是次要驱动因素，这与我们的假设相反。与USCα和USCγ相关的微生物被认为在高地草甸和森林土壤中主导了大气CH?的氧化。USCγ似乎在接近中性的土壤pH值下占主导地位，而USCα则常见于酸性土壤。我们的研究以及少数其他基于北极的研究似乎证实了USCα和USCγ在北极苔原生态系统中的pH依赖性主导。通常只有USCα被发现，这可能是因为研究的北极苔原生态系统中酸性条件的存在。USCα和USCγ类群中的微生物可能通过不同的策略适应不同的环境条件，这表明CH?氧化在Trail Valley Creek是一个稳健的过程，发生在广泛的CH?浓度和环境条件下。因此，即使短期的表面湿润（如融雪或降雨事件），也不会导致这些苔原微生境的显著CH?排放，除非冻土融化形成了持续湿润的热喀斯特特征（图S2）。

在研究的微生境中，我们观察到CH?通量的差异可能与氮循环基因的丰度有关。尽管结果对营养相关驱动因素对基因丰度和CH?吸收的影响尚不明确，但我们的研究确实观察到了不同微生境之间氮循环基因的显著差异。与反硝化和DNRA相关的基因在高地苔原中尤为重要，而与生物固氮相关的基因在多边形苔原中更为显著。虽然传统的理解认为氮添加，特别是氨和亚硝酸盐（NO??），会抑制CH?氧化，但氮和磷的可用性可能对微生物群落产生不同的影响。此外，微生物群落通过生物固氮或DNRA等不同策略获取氮，这可能会影响CH?氧化，并导致生态系统CH?吸收动态的时空变化。

总体而言，本研究的结果表明，甲烷氧化菌群落的结构在不同的苔原微生境中表现出显著的适应性，这些微生境对大气CH?的吸收具有重要影响。通过针对性测序功能基因，我们发现甲烷氧化菌的丰度与土壤pH值和湿度密切相关。尽管USCα在多边形苔原中相对丰度较高，但USCγ在高地苔原中更为显著。这些结果强调了在北极苔原土壤中，对甲烷氧化菌与氮可用性之间的相互作用进行深入研究的重要性。未来的研究可以通过结合生物地球化学调查和基因表达测量，探索甲烷氧化的机制，特别是高亲和力的甲烷氧化。此外，未来的研究还应探索将详细的微生物群落结构纳入北极土壤CH?吸收的生物地球化学建模的可能性。