废水微生物组中反硝化原生生物内共生体的全球分布与动态及其对温室气体排放的潜在影响

《ISME Communications》：Occurrence and temporal dynamics of denitrifying protist endosymbionts in the wastewater microbiome

本研究针对废水处理厂（WWTP）中关键氮去除过程——反硝作用的微生物驱动机制展开探索。研究人员通过宏基因组学、时间序列扩增子分析和荧光原位杂交（FISH）等技术，首次系统揭示了与纤毛虫（Plagiopylea类）形成专性内共生关系的反硝化细菌（Candidatus Azoamicaceae科）在全球WWTP中的广泛存在（20-50%的工厂）和高动态波动。研究成功回收了12个高质量宏基因组组装基因组（MAG），其中4个为环状完整基因组。值得注意的是，新物种Ca. Azoamicus parvus缺乏一氧化二氮还原酶（nosZ），表明其反硝化途径不完全，可能贡献于温室气体N2O的排放。该发现扩展了我们对微生物真核生物全息体在废水氮循环和温室气体产生中作用的认识，相关成果发表于《ISME Communications》。

　　

在维护公共卫生和保护自然环境的战役中，废水处理厂（WWTP）扮演着至关重要的角色。这些庞大的工程设施依赖复杂微生物群落的神奇力量，将污水中的有害污染物转化为无害物质。其中，将硝酸盐逐步还原为氮气（N₂）的反硝化过程，是去除废水中过量氮元素、防止水体富营养化的核心环节。长期以来，科学家们的目光主要聚焦于执行这一过程的自由生活细菌，而对其核微生物——特别是原生生物——及其体内共生菌的潜在贡献知之甚少。

近年来，一项突破性发现揭示了自然界中一种奇妙的共生关系：在一些厌氧纤毛虫体内，存在着一种名为“Candidatus Azoamicus ciliaticola”的细菌内共生体，它能够像线粒体一样，通过完整的反硝化作用为宿主细胞生产能量（ATP）。这种“呼吸伙伴”最初在淡水湖泊的缺氧层中被发现，随后其亲属也在全球多地地下水环境中检测到。更引人深思的是，初步的基因调查暗示，废水处理厂可能是这些反硝化内共生体的一个重要栖息地。然而，它们在人工处理系统中的真实多样性、分布规律、动态变化以及对氮循环的实际影响，仍然是一个待解之谜。

为了解决这些问题，由Louison Nicolas-Asselineau、Daan R. Speth等领导的研究团队在《ISME Communications》上发表了他们的最新研究成果。研究团队立志于绘制反硝化内共生体在全球化废水处理厂中的生态地图，并深入探究其基因组特征和宿主关联。

为了全面探索反硝化内共生体在WWTPs中的生态学，研究人员综合运用了多种关键技术方法。首先，他们从三大来源系统回收内共生体的宏基因组组装基因组（MAG）：1）已发表的23个丹麦WWTPs的长读长宏基因组组装数据；2）从公共数据库（Sandpiper和全球水微生物组联盟GWMC）中筛选出的相关废水宏基因组数据集；3）来自激活污泥微生物数据库（MiDAS）全球基因组目录的宏基因组数据。通过BLASTN比对、保守共线性分析和分箱（binning）流程，最终获得16个MAGs。其次，研究利用全球范围的16S rRNA基因扩增子数据集（来自GWMC和MiDAS 4项目），分析了内共生体（通过midas_f_1324家族近似代表）的地理分布和出现频率。第三，研究人员对四个丹麦WWTPs（Aalborg East, Aalborg West, Damhusaen, Randers）长达约2000天的时间序列扩增子数据进行分析，以揭示内共生体群落丰度和组成的动态变化。第四，为了确认宿主身份，研究团队对德国Seehausen WWTP进行了为期一年的采样（2022年10月，2023年8月和11月），并进行了宏基因组、宏转录组测序。最关键的是，他们设计了针对Plagiopylea类纤毛虫18S rRNA的特异性寡核苷酸探针（plagi1083），并结合之前已报道的针对内共生体16S rRNA的探针（eub62A3_813），对样品进行了双标记荧光原位杂交（FISH）和共聚焦激光扫描显微镜观察，直观地证实了内共生体与其推定宿主ciliate的细胞内共生关系。此外，研究还进行了系统基因组学分析（基于71个细菌单拷贝标记基因）、基因组注释以及系统发育分析（基于16S和18S rRNA基因），以确定新发现物种的分类地位和进化关系。

回收的反硝化内共生体MAGs显示出多样化的能量生产潜力

研究人员从废水测序数据集中成功回收了16个反硝化内共生体MAGs。其中12个为高质量MAGs（完整度>90%），4个为中等质量MAGs。尤为重要的是，有4个MAGs是环状完整的基因组。基于基因组特征和与已知基因组的共线性，研究提出了三个新的Azoamicus属物种：Candidatus Azoamicus mariagerensis, Candidatus Azoamicus parvus 和 Candidatus Azoamicus michiganensis。

基因组注释显示，所有MAGs都编码了反硝化内共生体的关键代谢途径，支持其与宿主进行能量生产和交换的功能。几乎所有MAGs都编码了完整的反硝化途径（硝酸盐还原酶narGHI, 亚硝酸盐还原酶nirK, 一氧化氮还原酶norBC, 一氧化二氮还原酶nosZ）。然而，新物种Ca. A. parvus的完整基因组却缺少整个nosZ操纵子（nosDLFRYZ），这意味着其反硝化途径是不完整的，可能以N₂O为终点产物。所有MAGs都编码了电子传递链的核心复合物（复合物I, II, III, V）。与之前描述的地下水物种类似，大多数（12/16）废水MAGs拥有编码细胞色素cbb₃氧化酶（复合物IV）的完整操纵子，表明它们除了能利用硝酸盐外，还具有进行有氧呼吸的潜力。负责ATP转运的关键蛋白——ATP/ADP转运酶（tlcA）在所有MAGs中都存在。

系统基因组学分析表明，废水中的内共生体物种并非单系群。它们与来自湖泊和地下水的已知物种交织在不同的进化支中。

反硝化内共生体的全球分布

通过对GWMC和MiDAS 4的全球16S rRNA基因扩增子数据集进行分析，研究发现反硝化内共生体（通过midas_f_1324家族代表）在所有有人类居住的大洲的WWTPs中均有发现。Azoamicaceae在GWMC调查的WWTPs中的49.3%（132/268）以及MiDAS 4调查的WWTPs中的19.6%（123/626）中被检测到。Ca. A. parvus物种尤其广泛分布。这些内共生体存在于处理不同废水强度和操作条件各异的多种WWTPs类型中，显示出其对不同环境参数的适应能力。

反硝化内共生体丰度的时间动态

对四个丹麦WWTPs长时间序列数据的分析揭示了内共生体丰度和组成的显著时间波动。它们的相对丰度随时间剧烈变化，偶尔会出现短暂的“水华”现象。某些物种表现出季节性出现模式，例如midas_s_5731通常在Randers WWTP的夏季被检测到，而midas_s_1324（Ca. A. mariagerensis）在Aalborg East WWTP的秋季出现。不同WWTPs内共生体群落的组成也不同，有的工厂多种物种共存，有的则被单一物种主导。总体而言，在这四个丹麦工厂中，Azoamicaceae在26-63%的采样点中被检测到，表明采样时间是影响其检测率的一个重要因素。

WWTPs中反硝化内共生体的推定宿主关联

已知的湖泊和地下水反硝化内共生体都与Plagiopylea类的纤毛虫相关联。为了确认废水内共生体的宿主，研究人员尝试从回收了MAGs的宏基因组中组装宿主18S rRNA基因序列，但仅从一个美国密歇根州的生物反应器样本中成功获得一条全长序列，该序列与已知宿主序列高度相似。

为了进一步探究，研究团队对德国Seehausen WWTP进行了采样。在所有样品中都检测到了多种反硝化内共生体物种，其中Ca. A. mariagerensis通常最丰富。从2022年10月的宏基因组中，成功组装出一条属于Plagiopylean纤毛虫的全长18S rRNA基因序列，推测是Ca. A. mariagerensis的宿主。

最关键的证据来自FISH实验。研究人员设计了针对Plagiopylea类18S rRNA的特异性探针（plagi1083），并将其与针对内共生体16S rRNA的探针（eub62A3_813）结合使用。共聚焦显微镜观察清晰地显示，内共生体的阳性信号仅出现在那些与Plagiopylea特异性探针杂交的纤毛虫细胞内，确凿地证明了废水中的反硝化内共生体栖息于Plagiopylean纤毛虫宿主内部。

研究结论与意义

本研究首次全面揭示了反硝化原生生物内共生体在全球废水处理厂微生物组中的广泛存在、高度动态的生态特征以及其代谢潜力的多样性。研究结果表明，这些与Plagiopylean纤毛虫形成专性内共生关系的Ca. Azoamicus属细菌，是激活污泥微生物群落中普遍但丰度较低的成员。它们在WWTPs中的成功定殖表明其生态位可以扩展到与原始自然环境截然不同的人工工程系统。

基因组分析揭示了重要的代谢差异。大多数废水内共生体物种是兼性需氧菌，编码高亲和力的细胞色素cbb₃氧化酶，这有助于它们在波动的氧气条件下生存。然而，细胞色素cbb₃氧化酶和关键反硝化酶nosZ的丢失事件在进化过程中至少独立发生了两次。特别是新物种Ca. A. parvus，其基因组高度简化，并缺乏整个nosZ操纵子，导致其反硝化途径止步于N₂O。这一发现具有重要意义，因为它首次指出宿主相关的微生物也可能参与废水处理过程中温室气体N₂O的产生，尽管其相对丰度可能远低于自由生活的不完全反硝化细菌。

系统发育分析和FISH实验共同证实，废水中的反硝化内共生体与其湖泊、地下水中的亲属一样，都与Plagiopylea类纤毛虫宿主相关联。这种共生关系似乎是长期垂直遗传的。

尽管这些纤毛虫及其内共生体在WWTPs中广泛分布，但它们的低相对丰度提示，与丰富多样的自由生活反硝化细菌相比，它们对废水中氮去除的直接贡献可能较小。这与它们在类似Lake Zug的自然生态系统中的主导作用形成对比。因此，这项研究的意义在于，它强调了在评估废水处理过程的生态功能时，需要考虑原生生物及其共生体在捕食作用之外的潜在贡献，特别是在氮循环和温室气体排放方面。

综上所述，该研究极大地拓展了我们对一类新型微生物功能单元——反硝化内共生体——在人工环境下的多样性、分布和生态功能的认知。它不仅为微生物生态学提供了新的见解，也为理解和优化废水处理过程中的氮管理及温室气体减排策略提供了新的视角。未来，通过实验室生物反应器培养这些共生体，将有助于深入探究其生理学和宿主-共生体相互作用的细节。