原位监测细胞内NADP+/NADPH状态：用于碳代谢和毒素检测的工程化大肠杆菌氧化还原生物传感器

《Biosensors and Bioelectronics》：In situ monitoring of intracellular NADP+/NADPH state: Engineered E. coli redox biosensor for carbon metabolism and toxicant detection

开发基于soxRS/psoxS与lacZ报告基因的整细胞红氧化还原传感器，用于实时监测大肠杆菌内NADP+/NADPH比值变化，并拓展至三氯生等有机污染物的检测。通过共表达lacY增强底物摄取，实现颜色和电化学信号的直观读数，验证了不同碳源对红氧化还原状态的调控作用，建立了非破坏性内源性氧化还原监测新方法。

　　本研究聚焦于开发一种能够持续监测活细菌细胞内NADP?/NADPH氧化还原状态的全细胞生物传感器。这种生物传感器不仅能够用于生物生产过程的实时优化，还能在环境监测中发挥重要作用。在当前的研究中，科学家们采用了一种基于soxRS系统的生物传感器设计，将soxR与psoxS传感器与lacZ报告基因融合，从而构建出一个具有高灵敏度和实用性的生物传感器。这种设计使得细菌能够在不破坏细胞结构的情况下，通过颜色变化和电化学信号的响应，实现对细胞内氧化还原状态的监测。

在生物生产和环境监测过程中，了解细胞内的氧化还原状态对于调控代谢过程、优化营养供给和提高产物产量具有重要意义。尤其是在工业条件下，细菌常常面临复杂的环境变化，如营养波动、氧化应激或暴露于某些氧化还原循环化合物。这些变化会影响细胞内的NADP?/NADPH比例，进而影响其代谢活性和细胞功能。因此，开发一种能够实时、非破坏性地监测细胞内氧化还原状态的生物传感器，对于理解细胞行为和提高生物生产效率具有关键作用。

在本研究中，科学家们选择将soxRS系统作为基础，因为它在大肠杆菌中能够特异性地感知氧化应激和NADPH减少的环境条件。soxR蛋白含有两个[2Fe–2S]簇，这些簇在正常情况下处于还原状态（SoxR_red），并通过依赖NADPH的还原系统维持。当细菌遭遇氧化应激时，NADPH会被消耗在抗氧化反应中，例如由外界的氧化还原循环化合物（如绿脓菌素或甲基紫精）引发的反应。这种NADPH的减少会促进soxR的氧化（SoxR_ox），进而导致其构象变化并激活psoxS基因的转录。这一过程表明，soxR的激活与细胞内的NADP?/NADPH比例密切相关，因此，通过监测soxR的活性可以间接了解细胞内的氧化还原状态。

为了进一步提高生物传感器的实用性，研究人员引入了乳糖渗透酶（lacY）的持续表达，使得细菌能够直接摄取报告底物，如o-硝基苯基-β-半乳糖苷（ONPG）和p-氨基苯基β-D-半乳糖吡喃糖苷（PAPG）。这些底物在lacZ酶的作用下会被分解，产生可检测的颜色变化或电化学信号。这种设计不仅提高了生物传感器的灵敏度，还增强了其在不同环境条件下的适用性，特别是在厌氧或工业条件下，传统依赖氧气的报告系统可能无法正常工作。

本研究还测试了多种碳源对细胞内NADP?/NADPH比例的影响，包括乙酸、葡萄糖、木糖和甘油。这些碳源在细菌代谢过程中扮演着重要角色，不同的碳源会导致不同的代谢途径和氧化还原状态变化。通过观察颜色变化和电化学信号，研究人员能够评估生物传感器对这些变化的响应能力。此外，研究还进一步将该生物传感器应用于检测有机污染物——三氯生，这是一种具有内分泌干扰作用的化学物质。通过使用丝网印刷电极，研究人员能够实现对三氯生的快速、准确检测，这表明该生物传感器在环境监测中具有广泛的应用前景。

在构建生物传感器的过程中，科学家们利用了大肠杆菌K-12菌株的lacY基因，将其扩增并克隆到pSEVA281质粒中。pSEVA281质粒由SEVA质粒平台提供，具有较强的基因表达能力。研究人员采用人工启动子BBa_J23119，确保lacY基因的持续表达。随后，该构建的质粒被导入到先前构建的红ox传感器菌株pRSUL12中，形成最终的pSLY红ox传感器菌株。这一菌株能够在不破坏细胞的情况下，通过lacY的持续表达和lacZ的报告功能，实现对细胞内红ox状态的实时监测。

为了验证该生物传感器的功能，研究人员在不同的碳源条件下培养该菌株，并观察其颜色变化。结果显示，葡萄糖仅轻微激活了psoxS:LacZ的表达，而乙酸则显著增强了该表达，这表明该菌株对不同碳源引起的代谢变化具有高度敏感性。此外，研究人员还通过标准的NADP?/NADPH检测试剂盒，对生物传感器的颜色变化与细胞内NADP?/NADPH水平进行了定量关联，进一步验证了其可靠性。

在实际应用中，该生物传感器不仅能够用于生物生产过程的优化，还能够拓展至环境监测领域。例如，在检测三氯生等有机污染物时，该生物传感器能够通过电化学信号的响应，提供快速、准确的检测结果。这为环境污染物的检测提供了新的方法，特别是在复杂基质如废水环境中，传统检测方法可能受到干扰，而该生物传感器则能够有效克服这一问题。

本研究的创新之处在于，它不仅开发了一种新的生物传感器，还通过结合lacY和lacZ基因，实现了对细胞内红ox状态的持续监测。这种设计使得细菌能够在不破坏细胞结构的情况下，通过颜色变化和电化学信号的响应，实现对红ox状态的实时检测。此外，该生物传感器的构建和应用还为未来的生物工程和环境监测提供了新的思路和工具。

在实际操作中，该生物传感器的构建需要经过多个步骤，包括基因扩增、克隆、质粒构建和菌株转化。研究人员首先从大肠杆菌K-12菌株中扩增lacY基因，并将其克隆到pSEVA281质粒中。随后，该质粒被导入到pRSUL12菌株中，形成最终的pSLY红ox传感器菌株。这一过程不仅需要精确的分子生物学技术，还需要对细菌的代谢和红ox调控机制有深入的理解。

在测试该生物传感器的功能时，研究人员使用了绿脓菌素作为诱导剂，以引发红ox应激，并观察颜色变化。结果显示，绿脓菌素能够显著激活lacZ的表达，从而导致ONPG的分解和颜色变化。这表明该生物传感器能够有效地检测外界的红ox循环化合物，并将其转化为可测量的信号。此外，研究人员还比较了在绿脓菌素诱导和未诱导条件下的细胞生长情况，发现未诱导条件下的细胞生长略高于诱导条件，这进一步说明了红ox应激对细菌生长的影响。

本研究的结果表明，该生物传感器能够有效地监测细胞内的NADP?/NADPH比例，并通过颜色变化和电化学信号的响应，实现对红ox状态的实时检测。这种检测方法不仅适用于实验室环境，还能够在实际应用中，如废水处理和生物生产过程中，提供可靠的监测手段。此外，该生物传感器的构建还为未来的生物工程和环境监测提供了新的可能性，特别是在需要实时、非破坏性监测的工业条件下。

在实际应用中，该生物传感器的构建和使用不仅需要科学的理论支持，还需要技术上的创新和优化。例如，在构建pSLY红ox传感器菌株时，研究人员采用了一种新的质粒构建方法，以确保lacY和lacZ基因的持续表达。这种方法不仅提高了生物传感器的灵敏度，还增强了其在不同环境条件下的适用性。此外，研究人员还通过不同的碳源测试，验证了该生物传感器对代谢变化的响应能力。

本研究的结论表明，该生物传感器能够有效地监测细胞内的NADP?/NADPH比例，并通过颜色变化和电化学信号的响应，实现对红ox状态的实时检测。这种检测方法不仅适用于实验室环境，还能够在实际应用中，如废水处理和生物生产过程中，提供可靠的监测手段。此外，该生物传感器的构建还为未来的生物工程和环境监测提供了新的可能性，特别是在需要实时、非破坏性监测的工业条件下。

在本研究中，研究人员不仅关注了生物传感器的构建和测试，还对其应用进行了拓展。例如，在检测三氯生等有机污染物时，该生物传感器能够通过电化学信号的响应，提供快速、准确的检测结果。这种应用不仅展示了该生物传感器的多功能性，还为环境污染物的检测提供了新的方法。此外，该生物传感器的构建还为未来的生物工程和环境监测提供了新的思路和工具。

综上所述，本研究开发了一种基于soxRS系统的全细胞红ox生物传感器，能够实现对细胞内NADP?/NADPH比例的持续监测。这种生物传感器不仅能够用于生物生产过程的优化，还能够在环境监测中发挥重要作用。通过结合lacY和lacZ基因，研究人员实现了对红ox状态的实时、非破坏性监测，为未来的生物工程和环境监测提供了新的可能性。此外，该生物传感器的构建和应用还展示了其在复杂基质中的适用性，特别是在检测有机污染物如三氯生时，能够提供快速、准确的检测结果。