在肽图谱分析中，由于非特异性切割相关的转肽作用而产生的伪序列变异

《Analytical Chemistry》：Artifactual Sequence Variant Induced by Nonspecific Cleavage-Linked Transpeptidation in Peptide Mapping

人工序列变异的形成机制及质谱分析中的应用研究。在抗体Fc区域C425S→C425R变异案例中，揭示非特异性切割关联的转肽作用（如Trypsin/Lys-C混合消化产生W417QQGNVFSC425R）是主要成因，并通过羰基甲基化差异（C425S比C425R切割效率高3.2倍）解释产物积累现象。研究建立了基于数据处理的生物药工艺优化中的变异识别方法。

　　

在细胞系开发和治疗性抗体的工艺优化过程中，识别可能影响安全性和效力的序列变异至关重要。蛋白质水平的序列变异分析通常采用LC–MS/MS肽图谱技术。然而，由于质谱分配不准确，常常会导致变异识别错误。此外，样品制备流程，特别是蛋白酶消化步骤，可能会无意中产生一些非生理性的序列变异，这些变异由于与真实变异具有相同的肽序列而难以区分。在这里，我们报告了一种人为产生的序列变异（例如，在抗体Fc区域中的C⁴²⁵S → C⁴²⁵R变异），并阐明了其形成机制。我们的研究发现，这类副产物是由于非特异性切割的肽链的氨基被转移到C末端所致，例如在Trypsin/Lys-C混合酶消化过程中，Arg被转移到W⁴¹⁷QQGNVFSC⁴²⁵上，从而形成W⁴¹⁷QQGNVFSC⁴²⁵R。与C⁴²⁵R相比，C⁴²⁵S上的氨基甲酰甲基具有更高的切割效率，这促进了副产物的积累。本研究证实，这类人为变异是通过非特异性切割过程中的转肽反应产生的，因此在数据处理过程中可以将其识别为分析误差。