一种简便且可重复的用于纯化肽和蛋白质功能化DNA纳米结构的方法

《JACS Au》：A Facile and Reproducible Method for the Purification of Peptide- and Protein-Functionalized DNA Nanostructures

DNA纳米技术在生物医药领域的应用面临规模化生产和安全性的挑战，本文提出一种基于重力驱动尺寸排阻色谱的高效纯化方法，适用于蛋白和肽修饰的纳米结构，纯度达99.9%以上，纯化时间缩短至10分钟内，并配套开发自动化分析工具，显著降低实验成本。

　　DNA纳米技术作为一种新兴的生物医学研究领域，正逐步展现出其在治疗和诊断方面的巨大潜力。该技术的核心在于利用DNA分子的自组装特性，构建出具有特定结构和功能的纳米级材料。这些结构不仅可以精确控制其组成、位置和方向，还能够承载多种生物活性分子，如蛋白质、多肽或小分子药物，从而为生物医学应用提供了高度可定制的平台。然而，尽管DNA纳米结构在实验室环境中展现出优异的性能，其在临床转化过程中仍面临两个主要挑战：一是如何实现低成本、高效率的大规模生产，二是如何建立全面的安全性评估体系。其中，可靠且高效的纯化方法是解决这两个问题的关键，也是当前DNA纳米技术领域亟待突破的难题。

为了应对这一挑战，研究者们提出了一种基于重力驱动的尺寸排阻色谱（G-SEC）方法，用于快速、高效地纯化功能化的DNA纳米结构。该方法的优势在于其操作简便、成本低廉，并且能够在短时间内达到较高的纯度和回收率。通过使用Cytiva SuperSEC树脂填充的0.8 mL柱体积（CV）柱，研究人员能够在10分钟内完成纯化过程，回收率可达93%，纯度超过99.9%。这一方法不仅适用于蛋白质和多肽修饰的DNA纳米结构，而且在小到中等规模的纯化（如1–10 μg DNA）中表现出良好的适用性。此外，该方法还具备一定的可扩展性，通过测试2.5 mL和5 mL CV柱，研究人员验证了其在更大规模下的稳定性，并且在连续使用10次后仍能保持良好的性能。

在本研究中，为了评估该方法的纯化效率，研究人员采用了多种分析手段。首先，他们利用琼脂糖凝胶电泳（AGE）检测DNA纳米结构和多余引物（staple strands）的分离情况，从而直观地判断纯化效果。其次，通过NanoDrop测量，他们能够快速估算每个收集组分中的DNA含量，进一步评估纯化过程中的回收率和纯度。为了提高分析的准确性，研究团队还开发了一种基于纳米滴定数据的计算方法，该方法通过拟合两个对数正态分布函数，计算出DNA纳米结构的纯度和分辨率。这种方法不仅简化了纯化效率的评估流程，还使得研究人员能够在不依赖复杂设备的情况下，对纯化过程进行定量分析。

研究结果表明，使用0.8 mL CV柱进行纯化时，DNA纳米结构主要在300 μL和400 μL的洗脱体积中出现，分别对应第3和第4个收集组分。通过NanoDrop测量，这些组分的总回收率达到了93%，纯度约为72.2%。而在单个组分中，第3组分的回收率和纯度分别为57.7%和98.9%，第4组分分别为35.0%和45.4%。这种高纯度和高回收率的纯化结果，表明该方法在去除多余引物和未结合分子方面具有显著优势。此外，通过原子力显微镜（AFM）观察，研究人员确认了纯化后的DNA纳米结构仍然保持其原始形态，未受到明显损伤。这说明该方法在维持结构完整性方面表现良好。

为了进一步验证该方法的适用性，研究团队还测试了不同类型的DNA纳米结构，包括二维结构（如矩形、三角形、5孔框架和框架）和三维结构（如四面体）。通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop测量，他们发现无论结构的复杂程度如何，G-SEC方法都能有效分离DNA纳米结构与多余引物，并且纯化效果具有良好的重复性。对于更复杂的结构，如双层三维DNA折纸结构，研究人员也展示了该方法在不同修饰条件下的适用性，包括未修饰、修饰锌-卟啉基团以及同时修饰锌-卟啉和适配体的结构。在这些情况下，纯化回收率分别为41.6%、63.8%和34.3%，进一步证明了该方法的通用性和灵活性。

除了对未修饰的DNA纳米结构进行纯化，研究团队还测试了该方法在纯化功能化结构中的表现。例如，他们将一种与tankyrase结合的多肽（TBP）连接到DNA三角形结构上，并在C末端添加Cy5荧光标记以方便检测。为了提高纯化效率，研究人员首先使用乙醇沉淀法浓缩DNA纳米结构，然后将其与多肽进行偶联反应。通过琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop测量和AFM成像，他们评估了偶联和纯化过程的效率。结果显示，经过乙醇沉淀浓缩后，多肽修饰的DNA纳米结构在G-SEC纯化中的回收率为64.3%，表明该方法在处理生物活性分子偶联的结构时具有较高的效率。此外，纯化后的样品中，多肽与DNA纳米结构的结合状态得到了有效分离，未结合的多余多肽和引物被成功去除，而DNA纳米结构则主要富集在第3个洗脱组分中。

为了验证G-SEC方法在处理蛋白质修饰结构时的适用性，研究人员还测试了生物素修饰的DNA矩形结构与链霉亲和素的结合情况。链霉亲和素是一种中性电荷的球形蛋白，常用于生物分子的纯化和检测。通过使用不同体积的G-SEC柱（0.8 mL、2.5 mL和5 mL），他们发现DNA纳米结构主要在第2至第4个洗脱组分中出现，而链霉亲和素则主要在第5至第9个洗脱组分中被分离。这种分离模式表明，G-SEC方法能够有效区分DNA纳米结构和大分子蛋白质，从而实现高纯度的纯化。AFM成像进一步确认了链霉亲和素修饰的DNA纳米结构在纯化后的完整性，表明该方法不仅能够高效分离，还能够保护纳米结构的物理和化学特性。

此外，为了全面评估G-SEC方法的性能，研究人员将其与现有的多种纯化方法进行了比较。这些方法包括传统的琼脂糖凝胶电泳提取、使用100 kDa分子量截断（MWCO）滤膜的超滤、离心式尺寸排阻色谱（如Sephacryl S-300）、乙醇沉淀法以及高速蛋白液相色谱（FPLC-SEC）等。通过分析这些方法在回收率、纯度、时间成本和适用规模等方面的差异，研究团队发现G-SEC方法在多个关键指标上具有明显优势。例如，与FPLC-SEC相比，G-SEC不需要昂贵的设备，且操作时间更短；与传统电泳法相比，其纯化效率更高，且能够实现自动化和高通量处理。同时，该方法对蛋白质修饰的结构具有良好的兼容性，避免了因高剪切力导致的结构损伤。

在实际应用中，G-SEC方法的可操作性和经济性使其成为DNA纳米技术向临床转化的重要工具。研究人员指出，该方法特别适用于需要在小到中等规模下进行纯化的生物医学应用，例如药物输送、基因治疗和生物传感器的构建。此外，由于其重力驱动的特性，该方法能够在无需复杂仪器的情况下完成纯化，降低了实验成本和操作门槛。同时，研究人员还开发了一个开放访问的计算工具，该工具能够基于NanoDrop测量数据快速计算纯化效率，包括回收率和纯度。这种工具的引入，使得研究人员能够在实验过程中实时监测纯化效果，从而优化实验条件，提高研究效率。

总体而言，G-SEC方法为DNA纳米结构的纯化提供了一种简单、快速、高效且经济的解决方案。其在保持纳米结构完整性的同时，能够实现高纯度和高回收率的纯化，适用于多种功能化结构，包括蛋白质和多肽修饰的纳米材料。随着DNA纳米技术在生物医学领域的不断深入，该方法的推广和应用将有助于加速其从实验室研究到临床应用的转化进程，为未来的精准医疗和纳米生物技术发展提供强有力的技术支持。