通过镜像噬菌体展示技术针对合成d-PD-1，发现能够抑制PD-1/PD-L1相互作用的d-迷你蛋白抑制剂

《JACS Au》：Discovery of d-Miniprotein Inhibitors of PD-1/PD-L1 Interaction via Mirror-Image Phage Display against Synthetic d-PD-1

PD-1/PD-L1相互作用抑制剂开发，镜像噬菌体展示技术，d-微球蛋白设计，NMR和MD模拟结合，纳米摩尔亲和力，细胞免疫抑制，短肽库筛选比较，结构活性关系，药物开发优化。

　　在免疫治疗领域，程序性死亡蛋白1（PD-1）作为一种重要的免疫检查点分子，其与程序性死亡配体1/2（PD-L1/2）的相互作用已成为癌症治疗的关键靶点。PD-1通过其广而平的结合界面与PD-L1/2相互作用，这种界面结构使得传统的非抗体类抑制剂开发面临巨大挑战。因此，开发具有高亲和力和良好生物活性的新型PD-1/PD-L1抑制剂，特别是非抗体形式的药物，具有重要的研究价值和应用前景。本文介绍了一种基于镜像展示技术（Mirror-Image Phage Display, MIPD）开发的首个PD-1/PD-L1相互作用的镜像最小蛋白（d-miniprotein）抑制剂，命名为DPDI-49，其对PD-1具有纳摩尔级别的结合亲和力，并在基于细胞的抑制实验中表现出单位微摩尔级别的中和效果。该研究不仅展示了d-miniprotein在PPI（蛋白质-蛋白质相互作用）抑制剂开发中的优势，也为免疫治疗领域提供了新的研究方向。

### PD-1与PD-L1的生物学意义

PD-1是一种由T细胞表达的免疫抑制性受体，其与PD-L1/2的结合在调节免疫应答中起着关键作用。在正常生理条件下，这种相互作用有助于防止自身免疫反应，避免T细胞对自身抗原的过度激活。然而，在某些癌症类型中，肿瘤细胞会高表达PD-L1，以逃避免疫系统的监视。PD-1/PD-L1的结合能够抑制T细胞的激活，从而降低免疫系统对肿瘤细胞的攻击能力。因此，开发针对PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂，特别是非抗体类药物，成为抗肿瘤治疗的重要策略。目前，已有多种单克隆抗体被批准用于PD-1/PD-L1的抑制，但这些抗体存在成本高、生产复杂以及可能引发免疫反应等局限性。因此，寻找具有更高生物活性、更优药物特性和更低免疫原性的非抗体抑制剂成为研究热点。

### d-miniprotein在PPI抑制剂开发中的潜力

与传统的短肽或小分子药物相比，d-miniprotein因其独特的结构特性而显示出在PPI抑制剂开发中的潜力。d-miniprotein是由d-构型氨基酸组成的最小蛋白结构，具有良好的稳定性、较低的免疫原性以及可调控的生物活性。这些特性使其成为开发新型免疫调节药物的理想候选分子。在本研究中，研究人员通过镜像展示技术，构建了一种41个氨基酸残基的d-miniprotein库，并以此为基础筛选出针对PD-1的高亲和力抑制剂DPDI-49。与其他商业短肽库相比，该d-miniprotein库在抑制剂筛选中表现更为优异，显示出其在复杂PPI靶点药物开发中的显著优势。

### 镜像展示技术的策略与优势

镜像展示技术是一种基于d-氨基酸构建的展示系统，能够有效克服传统l-氨基酸肽在结构稳定性、代谢和免疫原性方面的局限。该技术最早由Kim等人于1996年提出，并在随后的几十年中不断发展，成为一种高效、稳健的PPI抑制剂筛选平台。与传统策略不同，镜像展示技术不需要依赖已知的l-配体或靶蛋白的结构信息，从而降低了对靶蛋白三维结构解析的依赖。此外，该技术能够生成具有复杂二级结构的d-miniprotein，这些结构通常比短肽更具功能性和稳定性。在本研究中，研究人员利用镜像展示技术，结合计算模拟和分子动力学（MD）研究，深入解析了DPDI-49与PD-1的结合模式，进一步验证了其作为PPI抑制剂的潜力。

### DPDI-49的结构与功能分析

为了更好地理解DPDI-49与PD-1的相互作用机制，研究人员采用核磁共振（NMR）和分子动力学模拟等方法，对结合模式进行了系统研究。通过STD-NMR实验，研究人员初步确定了DPDI-49与PD-1的结合位点，发现多个关键残基如d-Arg、d-Tyr和d-Asn在结合过程中发挥重要作用。进一步的结构分析表明，这些残基不仅参与直接的氢键和盐桥相互作用，还对整体构象的稳定性具有关键影响。此外，通过改变特定残基（如d-Cys14→d-Ser14）并进行功能评估，研究人员发现某些结构修饰可能会显著影响其结合活性。例如，d-Cys14→d-Ser14的突变导致DPDI-49在细胞实验中完全失去活性，这表明其构象灵活性对于有效的生物功能至关重要。

### 分子动力学模拟揭示DPDI-49的结合机制

为了更深入地解析DPDI-49的结合机制，研究人员进行了多个分子动力学模拟实验。模拟结果显示，DPDI-49能够通过竞争性结合占据PD-1的结合界面，从而阻断PD-L1的结合。此外，模拟还发现，DPDI-49的结合位点可能在某些情况下发生构象变化，导致其与PD-L1的直接相互作用。这种结合模式可能通过双重机制发挥作用：一方面，DPDI-49通过占据PD-1的结合位点，阻止PD-L1的结合；另一方面，它可能通过与PD-L1的直接相互作用，进一步增强对PD-1/PD-L1复合物的阻断效果。这些发现不仅揭示了DPDI-49的作用机制，也为设计更高效的PPI抑制剂提供了理论依据。

### d-miniprotein的免疫原性优势

d-miniprotein相较于传统的l-肽和抗体药物，具有更低的免疫原性。这是因为d-构型的氨基酸无法被主要组织相容性复合体（MHC）II类分子有效呈递，从而降低了被免疫系统识别的可能性。这种特性对于长期治疗至关重要，因为免疫反应可能限制药物的疗效和安全性。在本研究中，研究人员通过实验验证了d-miniprotein在免疫应答中的潜在优势，这为其在抗肿瘤免疫治疗中的应用提供了重要支持。

### DPDI-49的生物活性与优化方向

尽管DPDI-49在体外实验中表现出纳摩尔级别的高亲和力，但在基于细胞的实验中，其效力稍低（EC50为8.45 μM）。这种差异可能源于多种因素，包括药物在细胞培养基中的非特异性结合、对免疫突触的有限渗透性以及PD-1/PD-L1在细胞膜表面的聚集效应。因此，进一步优化DPDI-49的生物活性和药代动力学特性，仍然是未来研究的重点方向。可能的优化策略包括引入聚乙二醇（PEG）修饰以延长半衰期、添加肿瘤靶向结构以提高药物在肿瘤部位的富集能力，以及基于DPDI-49与PD-1的结合结构开发共价结合剂，从而增强其抑制效果。

### 结论与展望

本研究成功开发了首个针对PD-1/PD-L1相互作用的d-miniprotein抑制剂DPDI-49，其在体外和细胞实验中均表现出良好的抑制活性。这一成果不仅验证了d-miniprotein在PPI抑制剂开发中的潜力，也为镜像展示技术在药物研发中的应用提供了新的思路。尽管DPDI-49在体外表现出更高的亲和力，但在体内应用时仍需进一步优化其药代动力学特性。未来的研究可以集中在提升其在细胞环境中的稳定性、延长其在体内的半衰期以及增强其对肿瘤微环境的靶向能力。此外，基于DPDI-49与PD-1的结合结构，开发具有更高选择性和特异性的药物，将是进一步推动镜像疗法发展的关键方向。通过不断优化和改进，d-miniprotein有望成为新一代免疫治疗药物的重要组成部分，为癌症治疗提供更加安全、高效的解决方案。