tRF-24通过驱动CELF1相分离促进食管鳞癌致癌性剪接的机制研究

《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：tRNA-derived fragment tRF-24 drives CELF1 phase separation to promote oncogenic splicing in esophageal squamous cell carcinoma

本研究针对食管鳞癌(ESCC)预后差、分子机制不清的问题，系统揭示了tRNA来源片段tRF-24通过抑制CELF1蛋白Ser28位点磷酸化，促进其核转位和液-液相分离(LLPS)，进而调控BIN1和BECN1基因的可变剪接，最终驱动肿瘤恶性进展的新机制。该发现不仅阐明了tsRNA在ESCC中的重要作用，还为开发靶向tRF-24的治疗策略提供了理论依据。

　　

食管鳞状细胞癌(ESCC)是中国高发的消化道恶性肿瘤，多数患者确诊时已处于晚期，五年生存率不足20%，这迫切要求我们深入探索其发病机制并寻找新的治疗靶点。近年来，tRNA来源的小RNA(tsRNAs)作为非编码RNA的重要亚类，在肿瘤发生发展中的调控作用日益受到关注，但其在ESCC中的功能网络仍知之甚少。

在这项发表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》的研究中，胡亚杰等人聚焦于一个名为tRF-24-RPM8309M2S(tRF-24)的tsRNA。他们发现，tRF-24在ESCC肿瘤组织中显著上调，且高表达与患者的不良生存预后密切相关。功能实验表明，tRF-24能够促进ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化(EMT)、自噬、线粒体自噬、DNA损伤修复、顺铂耐药和糖酵解代谢，在体内外均显示出强大的促癌能力。

为了揭示其分子机制，研究人员主要运用了以下关键技术：基于96例ESCC患者队列的临床样本分析、RNA pull-down联合质谱分析筛选互作蛋白、点突变技术验证结合位点、活细胞成像和荧光漂白恢复(FRAP)技术分析蛋白质相分离、RNA测序(RNA-seq)和可变剪接分析、以及小鼠异种移植模型评估靶向治疗的疗效。

tRF-24促进ESCC的恶性进展

研究人员首先通过对公共数据库GSE207635和齐鲁医院96例ESCC患者队列的分析，发现tRF-24在肿瘤组织中显著高表达，且与晚期分期和不良预后相关。功能获得和功能缺失实验证实，tRF-24能够显著增强ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。在动物实验中，过表达tRF-24加速了移植瘤的生长，而敲低tRF-24则抑制了肿瘤生长，明确了tRF-24的致癌角色。

tRF-24促进自噬和线粒体自噬

研究进一步发现tRF-24能够激活ESCC细胞的自噬和线粒体自噬。过表达tRF-24增加了LC3-II/I的转化，降低了p62的水平，并促进了自噬流。同时，线粒体自噬关键蛋白PINK1和Parkin的表达也随tRF-24水平升高而增加，线粒体与自噬体的共定位现象更为显著。这些结果表明tRF-24通过激活这些细胞自我保护通路，为肿瘤细胞在应激条件下的生存提供了优势。

tRF-24与CELF1相互作用并抑制其Ser28位点磷酸化

为了探寻tRF-24的作用机制，研究者通过RNA pull-down和质谱分析，鉴定出RNA结合蛋白CELF1是tRF-24的直接相互作用蛋白。进一步的机制探索揭示，tRF-24结合在CELF1的RRM1结构域，并特异性干扰了AKT1激酶对CELF1第28位丝氨酸(Ser28)的磷酸化。这种抑制作用阻碍了磷酸化驱动的CELF1胞质定位，导致CELF1在细胞核内聚集。

CELF1发生液-液相分离(LLPS)

核内聚集的CELF1被发现能够通过其内在无序区域(IDR)发生液-液相分离(LLPS)，形成动态的核内凝聚体。FRAP实验证实了这些凝聚体具有液状性质，可被相分离抑制剂1,6-己二醇破坏。重要的是，tRF-24过表达引起的CELF1核内富集，进一步促进了CELF1相分离凝聚体的形成。

tRF-24通过CELF1相分离调控BIN1和BECN1的可变剪接

核内CELF1是重要的可变剪接调控因子。RNA-seq分析显示，tRF-24或CELF1的过表达能共同调控一批基因的可变剪接事件，其中尤为重要的是肿瘤抑制基因BIN1和自噬关键基因BECN1。tRF-24/CELF1轴促进了促癌的BIN1-L亚型（包含12a外显子）和促自噬/线粒体自噬的BECN1-α亚型（缺失11外显子）的产生。挽救实验证明，CELF1的下调可以逆转tRF-24过表达所引发的恶性表型及剪接模式改变，且CELF1的相分离能力对其调控剪接的功能至关重要。

靶向tRF-24展现出治疗潜力

最后，研究团队在ESCC小鼠移植瘤模型中验证了靶向tRF-24的治疗潜力。通过静脉注射特异性抑制tRF-24的antagomir（拮抗剂），能够显著抑制肿瘤生长，并下调下游BIN1-L和BECN1-α等致癌蛋白的表达，且未表现出明显毒性。对临床ESCC样本的分析也显示，tRF-24高表达的患者其肿瘤组织中自噬和线粒体自噬标志物水平更高，疾病进展更快。

综上所述，本研究首次揭示了tRF-24-CELF1-LLPS-BIN1/BECN1这一全新的信号轴在ESCC发生发展中的核心作用。它不仅阐明了tsRNA通过调控RNA结合蛋白的翻译后修饰和相分离来影响基因剪接的新机制，更重要的是，提出了将tRF-24作为ESCC预后生物标志物和潜在治疗靶点的新策略，为开发基于非编码RNA的癌症疗法提供了新的思路和实验依据。