《Frontiers in Immunology》：SPHK1-mediated M2 macrophage polarization drives TGF-β1-dependent thrombus fibrosis
静脉血栓纤维化是导致血栓后综合征（PTS）和慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）的重要因素。M2型巨噬细胞通过分泌转化生长因子-β1（TGF-β1）促进纤维化过程。本研究旨在探讨鞘氨醇激酶1（SPHK1）是否通过调控M2型巨噬细胞极化来促进血栓纤维化。研究采用了多种方法，包括对患者血栓组织的组织学染色和免疫荧光分析，单细胞RNA测序（scRNA-seq）用于分析免疫细胞的异质性以及SPHK1在巨噬细胞亚群中的表达情况。在体内实验中，研究人员利用大鼠下腔静脉（IVC）结扎模型，通过给予SPHK1抑制剂PF543来评估其对纤维化和巨噬细胞极化的影响。在体外实验中，研究人员对骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）进行M2极化，并与成纤维细胞共培养，以研究TGF-β1依赖的成纤维细胞激活。
研究结果表明，CTEPH血栓组织中存在显著的细胞浸润、纤维化重塑和SPHK1表达升高。通过组织学分析和分子检测，发现CTEPH血栓组织中胶原沉积和α-SMA阳性细胞显著增加，表明纤维化程度较高。免疫荧光分析进一步显示，SPHK1与M2型巨噬细胞标志物CD68的共表达显著增强，尤其是在疾病进展过程中。单细胞RNA测序分析揭示了SPHK1在M2型巨噬细胞亚群，尤其是MARCO-1簇中的高表达，并且其表达水平与TGF-β1分泌密切相关。体内实验显示，PF543治疗显著降低了血栓组织中的胶原沉积、TGF-β1表达和M2型巨噬细胞极化。体外实验中，SPHK1敲低显著抑制了BMDMs中TGF-β1、Arg1、CD36和FASN的表达，表明其对促纤维化巨噬细胞功能的抑制作用。共培养实验进一步证实了M2型巨噬细胞通过TGF-β1依赖机制激活成纤维细胞。
研究结论指出，SPHK1通过促进M2型巨噬细胞极化和驱动TGF-β1依赖的血栓纤维化，其在CTEPH的进展中起着关键作用。PF543作为一种SPHK1抑制剂，能够有效减轻纤维化重塑并抑制M2型巨噬细胞极化，这表明SPHK1可能成为治疗慢性血栓相关纤维化的有前景的靶点。这些发现为慢性血栓性疾病的发展提供了新的机制见解，并为未来的治疗策略提供了理论依据。
本研究的引入部分强调了静脉血栓形成（VTE）作为全球重要的致病因素，其包括深静脉血栓（DVT）和肺栓塞（PE）。尽管使用低分子量肝素、维生素K拮抗剂和直接口服抗凝剂等抗凝药物可以有效预防血栓形成，但仍有高达20%-50%的DVT患者发展为PTS，其特征是慢性血栓纤维化、疼痛、肿胀和溃疡。同样，25%-50%的PE患者会形成持续性血栓，导致肺血管的纤维化重塑，最终可能发展为CTEPH。CTEPH是一种严重的疾病，其3年生存率在没有治疗的情况下可能低至10%-20%。值得注意的是，部分患者即使接受了充分的抗凝治疗仍会发展为CTEPH，这表明非血栓相关的机制，如病理性的纤维化，在疾病进展中扮演了重要角色。
慢性血栓纤维化会导致血管阻塞和血栓溶解障碍。纤维化过程中，成纤维细胞的激活和细胞外基质（ECM）的过度沉积是其标志。对CTEPH患者肺动脉内膜切除术（PEA）样本的单细胞RNA测序分析显示，M2型巨噬细胞、成纤维细胞和α-SMA阳性的肌成纤维细胞显著浸润，揭示了CTEPH血栓重塑的免疫-纤维化特性。在这些免疫细胞中，巨噬细胞尤为重要，因为它们能够根据环境信号进行塑形。M2型巨噬细胞由IL-4和IL-13诱导，与组织修复和纤维化相关。这些细胞分泌促纤维化细胞因子，如TGF-β1和IL-10，这些因子可以激活成纤维细胞并促进ECM的积累。
最近的研究表明，M2型巨噬细胞的极化与细胞内脂质代谢密切相关，这支持了其抗炎和促修复的功能。脂质代谢的紊乱已被证明在多种纤维化疾病模型中调控M2极化。在CTEPH患者的血栓组织中，TGF-β1的表达显著升高，这提示了M2型巨噬细胞的持续激活。作为一种关键的促纤维化细胞因子，TGF-β1进一步增强M2极化和成纤维细胞激活，从而促进ECM沉积和纤维化重塑。
SPHK1是一种调控鞘氨醇脂代谢的关键酶，在脊髓损伤和肝纤维化等疾病中已被证明可以调节炎症激活和纤维化。然而，其在血栓纤维化中的作用尚未被研究。本研究通过分析人类血栓样本、单细胞转录组学、体外巨噬细胞-成纤维细胞共培养系统以及大鼠模型中的药理学抑制，探讨了SPHK1在血栓纤维化中的功能。研究发现，SPHK1在M2型巨噬细胞中高度表达，并通过TGF-β1分泌促进成纤维细胞激活，从而推动血栓纤维化。这些发现为慢性血栓性疾病的发病机制提供了新的见解，并表明SPHK1可能成为治疗此类疾病的新靶点。
在材料和方法部分，研究人员收集了急性血栓组织样本，并使用商业组织稳定溶液进行保存，以便进行单细胞悬液制备和后续的RNA测序。对于慢性血栓组织样本，研究人员利用公开的单细胞RNA测序数据，这些数据来自CTEPH患者的PEA样本，并从GEO数据库下载。经过质量评估和过滤后，研究人员对剩余的三个样本进行了整合的单细胞分析。所有样本的诊断均依据2022年ESC/ERS指南进行。
为了验证实验结果，研究人员还收集了急性血栓和PEA组织样本，用于组织学和分子学研究。所有样本在切取后30分钟内处理，以确保实验的准确性。部分样本用于固定和石蜡包埋，以进行组织学分析，而其他样本则用于RNA和蛋白提取。通过显微镜评估和图像采集，研究人员确保了样本的准确采样，避免了邻近血管结构的污染。
在动物模型和血栓组织收集方面，研究人员使用了Sprague-Dawley（SD）大鼠，这些大鼠在特定病原体无（SPF）设施中饲养。通过随机分配，将大鼠分为模型组和治疗组。研究人员通过部分结扎下腔静脉（IVC）诱导静脉血栓形成，并在手术后24小时开始给予SPHK1抑制剂PF543。PF543以5 mg/kg的剂量，通过腹腔注射每日一次，持续7天或14天。对照组则给予等体积的生理盐水。在指定的时间点，研究人员通过腹腔注射钠戊巴比妥钠（150 mg/kg）对大鼠进行安乐死，并按照美国兽医医学协会（AVMA）2020年指南进行处理。在解剖过程中，研究人员小心地剥离了包含血栓的IVC段，并移除了周围的结缔组织和脂肪，以确保样本的纯净。最后，仅收集血栓组织本身，用于后续的组织学、分子和生化分析。在整个实验过程中，研究人员对动物的体重、食物摄入和整体状况进行了每日监测，以评估治疗可能带来的不良反应。
在单细胞RNA测序和数据分析方面，研究人员使用了10x Genomics平台，对CTEPH和急性肺栓塞（APE）患者的血栓组织进行了单细胞悬液制备、文库构建和测序。原始测序数据通过CeleScope管道进行处理，包括解复用、比对到GRCh38参考基因组、条形码计数和唯一分子标识符（UMI）定量。数据的下游分析，包括质量控制、降维和聚类，使用了Scanpy（v1.9.3）在Python（v3.7）环境中进行。对于每个样本，研究人员排除了在少于5个细胞中表达的基因，以及在细胞中表达少于200个基因或线粒体基因含量超过10%的细胞。通过Harmony（版本0.0.6）处理批次效应，研究人员对数据进行了整合。细胞聚类基于CellID算法（版本0.1.0），分辨率参数设置为1.2，结果产生了22个不同的簇。每个簇的标记基因分析使用了“FindAllMarkers”函数，以默认参数进行。聚类结果通过t-SNE进行可视化，而细胞间配体-受体相互作用分析则使用了CellChat框架。
研究人员对巨噬细胞和单核细胞进行了重新聚类，以更详细地研究它们的异质性。通过调整分辨率参数，研究人员将这些细胞重新聚类为六个不同的亚群。伪时间轨迹重建使用了Monocle2（v2.22.0），通过高变异基因（HVGs）对细胞进行排序，以反映其在分化过程中的空间和时间进展。特征提取和降维使用了DDRTree算法和FindVariableFeatures函数。最终的轨迹通过plot_cell_trajectory函数进行可视化。
在苏木精-伊红（HE）和Masson三色染色方面，研究人员将血栓组织固定在4%多聚甲醛中24小时，然后进行石蜡包埋和切片。HE染色用于观察组织结构，而Masson三色染色则用于评估胶原沉积。染色后的组织切片在显微镜下观察，并使用ImageJ软件进行图像采集和分析。纤维化面积和细胞密度的定量分析用于比较不同处理组之间的差异。通过Panoramic SCAN II扫描仪对染色切片进行了全幅扫描。
在免疫荧光染色方面，研究人员使用了环境友好的脱蜡剂对石蜡包埋的组织切片进行脱蜡处理，并依次在绝对乙醇、95%乙醇和75%乙醇中进行再水化。抗原修复根据实验要求采用不同的方法，包括EDTA缓冲液（pH 9.0）、柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或微波加热。在完成水化后，研究人员使用10%正常血清在37°C下进行30分钟的封闭处理，以防止非特异性抗体结合。然后，将适量的初级抗体（50-100 μL）在适当稀释度下进行孵育，时间为4°C下的过夜。次日，研究人员将切片带回室温，并使用TBST缓冲液进行三次清洗。接着，加入次级抗体（50-100 μL）并在37°C下孵育30分钟。最后，使用DAPI对细胞核进行染色，并在黑暗中进行5分钟的孵育，随后进行三次TBST清洗。将切片使用抗褪色荧光封片剂封片，并在4°C下避光保存。使用荧光显微镜对染色切片进行观察和成像。通过ImageJ软件对高倍视野中的阳性染色区域进行定量分析。使用的初级抗体包括CD206（兔，1:500，24595，Cst）、CD68（兔，1:4000，Ab303565，Abcam）、iNOS（兔，1:250，ab283655，Abcam）、SPHK1（兔，1:200，10670-1-AP，Proteintech）和α-SMA（兔，1:2000，ab124964，Abcam）。对于免疫组化，使用了TGF-β1（兔，1:400，21898-1-AP，Proteintech）。
在RNA测序分析中，研究人员使用了TRIzol试剂提取总RNA，并使用2100 Expert Bioanalyzer（Agilent）对RNA质量进行评估。RNA测序在Illumina HiSeq 2000平台上进行，由Majorbio Biotech（上海，中国）完成。数据分析通过I-Sanger云平台进行。两组之间的差异表达分析使用了DESeq2包。基因或转录本的差异表达被定义为假发现率（FDR）<0.05且绝对倍数变化≥2。
基因集富集分析在I-Sanger平台上进行。将基因表达矩阵上传，并根据实验组和对照组之间的log2倍数变化对基因进行排序。KEGG（京都基因与基因组百科全书）基因集作为参考数据库进行富集分析。显著富集被定义为归一化富集得分（NES）>1，FDR<0.05，且P值<0.05。I-Sanger平台自动生成富集图和详细统计报告，提供了显著富集的基因集及其相关的生物通路列表。
Reactome通路富集分析也在I-Sanger平台上进行。将差异表达基因（DEGs）上传并分析Reactome通路数据库。通路富集的显著性通过超几何检验进行评估，P值<0.05的通路被视为显著富集。富集结果通过气泡图进行可视化，展示了DEGs在富集通路中的生物学功能和相互作用。
在大鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）的分离和M2极化诱导方面，研究人员遵循标准协议。通过剪断大鼠的股骨和胫骨，收集骨髓细胞。使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗骨髓腔，并在无菌离心管中收集骨髓细胞。细胞悬液通过70 μm细胞筛过滤，以去除骨碎片和碎片，然后在300 × g下离心5分钟。去除上清液后，将细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）中。将细胞接种到无菌培养皿中，并在37°C、湿度和5% CO2的环境中培养。为了促进巨噬细胞分化，添加了20 ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子（C470，Novoprotein）。每两天更换一次培养基，其中包含M-CSF。经过7天的诱导后，通过流式细胞术评估CD11b和CD68的双阳性表达以确认巨噬细胞的身份。对于M2极化，将成熟的BMDMs用PBS洗涤，并在无血清培养基中培养，其中包含20 ng/mL的IL-4（400-04，PeproTech）。细胞在标准条件（37°C、5% CO2）下培养48小时。诱导后，收集M2极化的巨噬细胞用于功能实验和进一步研究。
在从血栓组织中分离和培养成纤维细胞方面，研究人员从IVC结扎模型中收集血栓组织，并立即用含抗生素的PBS冲洗以去除残留的血液和减少污染。将组织转移到无菌培养皿中，并用无菌剪刀精细剪碎以最大化酶解面积。使用Tissue Dissociation Kit（Miltenyi Biotec，德国）按照制造商的说明进行组织消化。将剪碎的组织转移到C管中，加入4.7 mL预热的无血清培养基（SFM）以优化酶活性。机械解离使用GentleMACS Dissociator（Miltenyi Biotec，德国）进行，并在37°C水浴中孵育30分钟。这一机械解离和酶解的循环重复两次以确保有效的组织解离。在最后一次机械步骤后，通过加入20 mL PBS终止酶解。将细胞悬液通过70 μm细胞筛过滤以去除未解离的组织碎片。过滤后的细胞在300 × g下离心5分钟，去除上清液后，将细胞沉淀重悬于含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中，并接种到培养皿中。细胞在37°C、湿度和5% CO2的环境中培养。在24小时后，更换培养基以去除非贴壁细胞，并每2-3天更换一次新鲜培养基。为了选择性富集成纤维细胞，使用了差异贴壁方法，利用成纤维细胞快速贴壁的特性。这种方法在培养基更换过程中逐渐富集和扩展成纤维细胞。在7-10天内观察到贴壁细胞的单层，此时细胞可进行传代，用于后续实验。
在共培养系统中，研究人员使用了条件培养基（CM）方法。首先将M2极化的巨噬细胞单独培养48小时，收集并过滤上清液以获得M2条件培养基（M2-CM），并在4°C下储存以备使用。将成纤维细胞接种到6孔板中，密度为1 × 105个细胞/孔，并在48小时后与不同类型的条件培养基共培养。使用光学显微镜观察成纤维细胞在不同条件下的形态变化。此外，进行免疫荧光染色和Western blot分析以评估成纤维细胞中α-SMA的表达情况。表1列出了共培养系统中使用的四种处理和细胞类型。
在Western blot分析中，研究人员从细胞和组织中提取总蛋白，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，随后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）上。膜用10%非脂肪牛奶进行封闭，并依次与初级和次级抗体孵育。使用增强化学发光（ECL）底物（MA0186-1，Meilunbio）和化学发光成像系统（SCG-W3000，Saivill）进行蛋白条带的可视化。使用的初级抗体包括SPHK1（兔，1:5000，10670-1-AP，Proteintech）、CD68（兔，1:1000，ERP23917-164，Abcam）、CD206（兔，1:1000，24595，CST）、iNOS（兔，1:1000，EPR16635，Abcam）、精氨酸酶-1（兔，1:1000，93668，CST）、TGF-β1（兔，1:1000，EPR21143，Abcam）、α-SMA（兔，1:50000，ET1607-53，Huabio）、MMP9（兔，1:1000，RM1020，Abcam）、磷酸化STAT3（Tyr705）（兔，1:1000，9145，CST）和STAT3（兔，1:1000，12640，CST）。HRP偶联的次级抗体和ECL用于检测。β-actin作为内部加载对照。
在定量实时PCR（qRT-PCR）中，研究人员使用SYBR Green系统进行实验，并通过2^–ΔΔCt方法分析数据。从细胞中提取总RNA，并使用Fast RNA Extraction Kit（AG21023）进行逆转录，生成互补DNA（cDNA）使用Evo M-MLV RT Premix Kit（AG11728）。qRT-PCR使用SYBR? Green Pro Taq HS Premix qPCR Kit（AG11718）进行。用于扩增的引物序列列于表2中。基因表达水平以β-actin作为内部对照进行标准化。
在流式细胞术分析中，研究人员通过胶原酶消化制备单细胞悬液。在Fc受体阻断后，使用以下抗体进行染色：CD11b-FITC（201805，Biolegend）、CD68-APC（bs-20403R，Bioss）、CD163-RY610（759119，BD OptiBuild）和7-AAD（AP104，MultiScience）用于排除细胞活性。数据使用CytoFLEX LX流式细胞仪采集，并通过FlowJo软件分析以确定CD68+CD11b+CD163+ M2极化巨噬细胞的比例。
在酶联免疫吸附测定（ELISA）中，研究人员使用商业ELISA试剂盒（Elabscience，E-EL-0162）测量成纤维细胞培养上清液中TGF-β1的浓度。简要步骤包括将收集的上清液加入预包被有特定抗体的微板，孵育后加入检测试剂，并在450 nm处使用微板读数仪测量吸光度。TGF-β1浓度基于标准曲线计算。所有样品均以重复方式检测。
在统计分析中，数据以均值±标准差（SD）的形式呈现。两组之间的统计差异使用非配对Student’s t检验评估，而多组比较使用双因素方差分析（ANOVA）并进行Bonferroni事后校正。P值<0.05被视为统计学显著。数据可视化和统计分析使用GraphPad Prism 9.0和R软件进行。
研究结果部分首先探讨了CTEPH血栓中增强的免疫细胞浸润、纤维化重塑和SPHK1表达。通过组织学和分子分析，研究人员比较了急性肺栓塞（n=6）和CTEPH（n=6）患者的血栓样本。H&E染色显示急性血栓主要由红细胞和松散的炎性细胞组成，而CTEPH血栓表现出密集的细胞浸润和组织结构。Masson三色染色显示CTEPH血栓中存在大量的胶原沉积，表明纤维化程度较高。免疫荧光分析进一步表明，CTEPH样本中CD68+巨噬细胞浸润和α-SMA+纺锤形细胞显著增加，这些细胞代表激活的成纤维细胞或肌成纤维细胞（
图1A、B）。
为了探讨潜在的分子变化，研究人员评估了关键促纤维化和Th2型炎性细胞因子的蛋白表达。Western blot分析显示，CTEPH血栓中IL-4、IL-13和TGF-β1的水平显著高于急性血栓（
图1C、E）。同时，研究人员发现SPHK1的表达在CTEPH样本中也显著升高（
图1D、E）。这些结果表明，CTEPH中的慢性血栓特征为持续的炎症、免疫细胞招募、成纤维细胞激活和SPHK1相关的纤维化信号。
进一步通过单细胞RNA测序分析了不同疾病阶段血栓组织的细胞异质性和基因表达谱。研究人员对来自3名CTEPH患者和6名急性肺栓塞患者的血栓组织进行了单细胞RNA测序。t分布随机邻域嵌入（tSNE）分析识别出多个明确的细胞簇（
图2A）。质量控制指标确认了所有样本具有足够的测序深度、高检测基因数和适当的线粒体基因比例，表明数据质量较高（
图2B）。基于经典标志基因，研究人员标注了主要的细胞群体，包括单核细胞/巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞、B细胞、内皮细胞和成纤维细胞（
图2C）。
研究人员随后分析了SPHK1在不同细胞簇中的表达情况。值得注意的是，SPHK1在单核细胞/巨噬细胞簇中高度富集（
图2D）。比较分析显示，CTEPH样本中SPHK1在多个细胞类型中显著升高，其中单核细胞/巨噬细胞的增加最为显著（
图2E）。这些发现表明，SPHK1可能在CTEPH血栓慢性重塑中发挥细胞类型特异性调控作用。
为了进一步研究巨噬细胞的异质性及其与SPHK1的关系，研究人员对单核细胞/巨噬细胞群体进行了亚群分析。基于tSNE的重新聚类识别出六个不同的亚群：经典单核细胞、非经典单核细胞、树突状细胞（DCs）以及三种MARCO+巨噬细胞亚群（MARCO-1、MARCO-2、MARCO-3）（
图2F）。基因特征分析显示，MARCO-1巨噬细胞表达了与炎症、脂质代谢和促血管生成相关的高水平基因（
图2G），这表明MARCO-1巨噬细胞具有功能活跃的“混合极化”表型。伪时间分析显示，MARCO-1亚群位于分化轨迹的后期阶段，这表明这些细胞可能代表成熟的亚群，而不是短暂的激活状态（
补充图S1）。
通过热图可视化，研究人员确认了不同巨噬细胞亚群中关键极化标志物，包括CD68、IL1B、MRC1和SPHK1的表达模式（
图2H–I）。值得注意的是，tSNE共定位图显示SPHK1在MRC1+的MARCO-1细胞中优先富集（
图2J），这表明尽管存在异质性，SPHK1可能与M2导向的轨迹相一致。支持这一点的是，伪时间轨迹分析重构了从单核细胞到巨噬细胞的分化过程（
图2K），显示CD163、MRC1和SPHK1的表达在分化过程中逐渐增加。
为了进一步探讨SPHK1表达与巨噬细胞极化的关系，研究人员对大鼠IVC结扎模型中血栓组织在结扎后第3天和第7天的表达进行了系统分析。SPHK1和CD68的双重免疫荧光染色显示，SPHK1主要在CD68+巨噬细胞中表达，且在第7天时表达显著增加（
图3A）。荧光强度剖面图确认了SPHK1和CD68之间存在显著的空间重叠（
图3B）。随后，研究人员通过Western blot分析评估了血栓组织中关键的纤维化和极化相关蛋白的表达。结果显示，CD68和M2标志物CD206在第7天显著上调，而M1标志物iNOS则显著下调（
图3C、D）。为了明确第3天iNOS表达的细胞来源，研究人员进行了iNOS和CD68的双重免疫荧光染色，确认iNOS信号定位在CD68+巨噬细胞中（
补充图S2）。为了进一步定义SPHK1在不同巨噬细胞极化状态中的分布，研究人员进行了SPHK1与CD206（M2标志物）和iNOS（M1标志物）的双重免疫荧光染色。SPHK1在CD206+巨噬细胞中高度富集，而与iNOS的共定位则较为有限（
图3E、G）。通过ImageJ软件进行的定量共定位分析确认了SPHK1与CD206的重叠系数显著高于其与iNOS的重叠系数（
图3F）。
为了验证RNA测序结果，研究人员进行了RT-qPCR，以评估M2型巨噬细胞中的两个关键功能基因CD36和FASN。结果显示，在SPHK1敲低组中，这两个基因的表达显著下调（
图4J）。为了确定最有效的SPHK1靶向siRNA，并确认敲低效率，研究人员将三种siRNA序列（Si1、Si2、Si3）转染到BMDMs中，并通过Western blot分析确认SPHK1蛋白表达的降低。Si1实现了最高的敲低效率，因此被选为后续功能研究的siRNA。Western blot结果显示，SPHK1敲低显著降低了Arg-1和CD206蛋白的表达，而CD68水平未发生显著变化，这表明SPHK1主要调控巨噬细胞的功能状态，而非细胞数量（
图4L）。此外，TGF-β1和MMP9的水平也显著降低（
图4M），表明SPHK1敲低抑制了M2型巨噬细胞的促纤维化潜力。这些蛋白水平的变化进一步支持了SPHK1在维持M2极化和促纤维化作用中的关键作用。
研究讨论部分指出，SPHK1是鞘氨醇脂代谢途径中的关键酶，并且在癌症、心血管疾病和器官纤维化（包括肝纤维化和肺纤维化）中已被广泛研究。然而，其在血栓病理背景下的作用尚未被探索。本研究首次揭示了SPHK1在CTEPH血栓纤维化中的作用，特别是其在M2型巨噬细胞极化中的角色。这些发现与现有文献一致，但表明SPHK1在免疫-纤维化轴中的新应用，为未来研究提供了新的方向。
本研究的材料和方法部分强调了对血栓组织样本的采集和处理过程，确保了实验的可靠性和数据的准确性。研究人员通过多种技术手段，包括组织学染色、免疫荧光分析和单细胞RNA测序，对血栓组织的异质性和基因表达进行了深入研究。通过比较不同疾病阶段的样本，研究人员发现CTEPH血栓组织中存在显著的细胞浸润、纤维化重塑和SPHK1表达升高。这些发现支持了巨噬细胞和成纤维细胞在纤维化过程中的关键作用。此外，研究人员还利用大鼠IVC结扎模型，模拟血栓形成及其纤维化反应，并通过给予SPHK1抑制剂PF543来评估其对纤维化和巨噬细胞极化的影响。在体内实验中，PF543显著降低了血栓组织中的胶原沉积、TGF-β1表达和M2型巨噬细胞极化。这些结果为SPHK1在调控M2极化-促纤维化轴中的作用提供了体内验证。
体外实验中，研究人员通过敲低SPHK1，发现其不仅抑制了促纤维化和免疫代谢分子的表达，还显著减弱了M2型巨噬细胞的表型特征。这些结果表明，SPHK1在维持M2型巨噬细胞促纤维化身份中的多方面作用。此外，SPHK1敲低还导致与ECM重塑和微环境重编程相关的多种通路的表达下调，包括TGF-β、PI3K-Akt和氧化磷酸化通路。这些结果与文献一致，表明TGF-β和PI3K-Akt信号通路在成纤维细胞激活、增殖和胶原沉积中起着重要作用。在肺和肝纤维化的研究中，氧化磷酸化已被证明是关键的代谢通路，调节氧化还原反应，并参与免疫细胞极化。未来的研究将进一步探讨SPHK1调控的代谢通路、免疫反应和促纤维化表型之间的关系。
在研究讨论中，研究人员指出SPHK1通过调控TGF-β1的产生并激活成纤维细胞中的STAT3信号通路，从而推动血栓纤维化。通过巨噬细胞-成纤维细胞共培养系统，研究人员观察到M2型巨噬细胞诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。免疫荧光分析显示，M2型巨噬细胞条件培养基（CM）处理后的成纤维细胞中α-SMA表达显著增加，这表明M2型巨噬细胞的旁分泌因子可以诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。Western blot分析进一步证实了M2型巨噬细胞条件培养基处理后α-SMA蛋白水平的显著升高。研究人员还通过单细胞RNA测序数据进行了细胞-细胞通信分析，揭示了成纤维细胞与来自Macro1的促纤维化配体之间的强信号连接。
为了验证SPHK1在血栓纤维化中的作用，研究人员使用了大鼠IVC结扎模型，并在结扎后第3天和第7天评估了不同时间点的血栓组织特征。通过免疫荧光染色，研究人员观察到SPHK1在CD68+巨噬细胞中的高度表达，并且在第7天时表达显著增加。荧光强度剖面图进一步确认了SPHK1和CD68之间的显著空间重叠。随后，研究人员通过Western blot分析了关键的纤维化和极化相关蛋白的表达情况。结果显示，CD68和M2标志物CD206在第7天显著上调，而M1标志物iNOS则显著下调。为了明确第3天iNOS表达的细胞来源，研究人员进行了iNOS和CD68的双重免疫荧光染色，确认iNOS信号位于CD68+巨噬细胞中。为了进一步定义SPHK1在不同巨噬细胞极化状态中的分布，研究人员进行了SPHK1与CD206（M2标志物）和iNOS（M1标志物）的双重免疫荧光染色。SPHK1在CD206+巨噬细胞中高度富集，而与iNOS的共定位则较为有限。通过ImageJ软件进行的定量共定位分析确认了SPHK1与CD206的重叠系数显著高于其与iNOS的重叠系数。
研究还指出，尽管大鼠IVC结扎模型在模拟血栓形成及其纤维化反应方面具有一定的局限性，如动物体内强纤维溶解活性可能导致血栓的快速溶解，使得难以完全复制CTEPH中组织化的血栓特征。然而，已有研究表明该模型部分重现了血栓的慢性性，并提供了关于血栓纤维化和免疫反应的实验证据。在本研究的体内实验中，使用PF543抑制SPHK1显著降低了大鼠血栓中的纤维化程度，这通过减少TGF-β1表达、减少α-SMA+肌成纤维细胞的积累和激活得以证实。这些结果为SPHK1在调控M2极化-促纤维化轴中的作用提供了体内验证。为了更准确地模拟CTEPH的慢性进展，未来的研究可能需要使用更复杂的动物模型，如涉及纤维溶解抑制或慢性免疫反应模拟的模型，以更好地重现CTEPH的病理特征。
尽管本研究提供了SPHK1在血栓纤维化中的初步证据，但仍存在一些局限性。首先，PF543作为一种药理学抑制剂，可能存在脱靶效应。未来的研究将使用基因模型，如SPHK1敲除小鼠，以消除非特异性效应。其次，当前的体外极化模型仅使用了IL-4和IL-13，未能完全模拟CTEPH的免疫微环境。未来的研究将使用额外的细胞因子和更复杂的模型，以更准确地反映CTEPH的病理特征。最后，由于CTEPH样本的数量有限以及潜在的选择偏差，未来的研究将扩大样本量，并纳入多中心数据以提高结果的可靠性。尽管PF543在本研究中显示出一定的治疗潜力，但其剂量和治疗窗口尚未优化。未来的研究将通过剂量梯度实验和长期药理学研究，评估其在慢性疾病中的疗效和安全性。
综上所述，本研究提供了多维度的证据，表明SPHK1在静脉血栓重塑中起着关键的促纤维化作用。SPHK1在M2型巨噬细胞中高度表达，并通过TGF-β1分泌促进成纤维细胞的激活，从而推动血栓纤维化。使用PF543进行SPHK1的药理学抑制显著减轻了大鼠血栓中的纤维化程度，并通过降低TGF-β1表达和抑制M2型巨噬细胞极化，从而减缓了血栓重塑的进展。这些发现为CTEPH和类似疾病的治疗提供了新的思路，并为未来的机制研究和治疗策略优化奠定了基础。
