综述：当前小干扰RNA的液相色谱-质谱分析趋势：简要综述

《Journal of Chromatography A》：Current Trends in Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis of Small Interfering RNAs: A Short Review

siRNA治疗剂研发进展及分析技术综述。siRNA因双链结构、化学修饰和递送系统复杂性导致质量分析挑战，LC-MS联用技术（IP-RP、AEX、SEC、HILIC）及多维色谱法成为关键手段，重点解决杂质分离（短/长链mer、PS异构体）、递送系统表征（LNP粒径、GalNAc结合）及药代动力学检测问题。

　　小干扰RNA（siRNA）作为一种新型的药物递送技术，近年来在制药领域得到了迅速发展。自2018年首个基于siRNA的药物Patisiran获批以来，已有七种siRNA药物进入临床应用。这些药物在制造过程中可能产生多种杂质，包括非优化的双链结构、单链杂质，以及由于合成过程中短链或长链副产物引起的结构偏差。此外，磷硫键的引入会带来手性，从而生成复杂的对映异构体混合物。为了提高siRNA在体内的稳定性和靶向性，研究人员常采用脂质纳米颗粒（LNP）或N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联物等递送系统，这进一步增加了最终药物产品的结构复杂性和异质性。

siRNA作为双链结构，相较于单链寡核苷酸，其在液相色谱（LC）和质谱（MS）分析中会产生更复杂的色谱图谱和质谱信号。因此，开发稳健且可靠的分析方法对于确保siRNA药物的质量至关重要。本文综述了当前用于siRNA药物质量评估的关键分析技术，重点介绍了LC和MS在杂质分析、异构体分离和药物纯度检测中的应用。此外，还简要讨论了LC和MS技术在siRNA药代动力学研究中的应用。

在LC技术中，常用的分离模式包括离子对反相（IP-RP）、阴离子交换（AEX）、尺寸排阻（SEC）和亲水相互作用（HILIC）。IP-RP是一种广泛应用的色谱方法，其原理是通过离子对试剂与siRNA的负电荷磷酸基团相互作用，从而实现保留。由于siRNA具有大约40个负电荷，它在常规反相柱上几乎无法保留，因此需要使用离子对试剂来克服这一问题。此外，由于siRNA的双链结构在色谱分析过程中容易被破坏，研究人员也在探索非变性条件下的IP-RP方法，以维持其天然结构并进行更准确的分析。

AEX作为一种电荷相互作用技术，适用于siRNA的分析。通过使用具有正电荷功能团的固定相，AEX可以与siRNA的负电荷磷酸基团形成静电相互作用，从而实现分离。尽管AEX在非变性条件下能够维持siRNA的双链结构，但其通常不兼容MS分析，因此需要结合其他技术，如二维LC（2D-LC）或混合模式色谱（MMC），以提高分析的全面性和准确性。

SEC则通过基于水动力半径的分离机制，适用于分析siRNA的单链杂质。尽管SEC在非变性条件下能够保持siRNA的天然结构，但其在分离具有相似分子量的杂质时效果有限。然而，近年来的研究表明，通过使用挥发性缓冲液，SEC可以与MS兼容，从而实现对siRNA的全面分析。

HILIC作为一种新兴的色谱技术，近年来在siRNA分析中也得到了关注。HILIC不需要离子对试剂，因此更适用于MS分析。此外，HILIC能够基于水分子的亲和力分离siRNA，特别是在高离子强度条件下，可以维持其双链结构并实现更高效的异构体分离。然而，HILIC在杂质分离效率方面仍存在一定的局限性。

在siRNA的分析中，MS技术发挥着重要作用。MS不仅能够提供基于分子质量的结构信息，还能用于识别活性成分和分析杂质。然而，由于siRNA的双链结构会带来更复杂的质谱图谱，因此在实际应用中需要结合LC技术，以实现对杂质的准确鉴定和定量。例如，串联质谱（MS/MS）能够提供序列特异性信息，从而帮助研究人员确定siRNA的结构和纯度。

在siRNA药物的制造过程中，化学修饰如磷硫键（PS）和糖基化修饰（如2’-O-甲基或2’-氟）被广泛使用，以提高其在体内的稳定性和靶向性。这些修饰可能会导致不同的对映异构体分布，影响siRNA的药效和安全性。因此，开发能够有效分离和鉴定这些异构体的分析方法变得尤为重要。一些研究表明，非变性条件下的IP-RP和AEX方法在对映异构体的分离中表现出较好的效果，而HILIC则在保持双链结构方面具有优势。

对于基于LNP的siRNA药物，分析其粒径分布、载药效率和脂质成分对于确保药物的质量至关重要。LC和MS技术被广泛用于这些分析，其中SEC是一种常用的分离方法，能够基于粒径差异实现对LNP的分析。此外，HILIC和IP-RP也被用于研究LNP中siRNA的代谢情况，以评估其在体内的稳定性和有效性。

GalNAc偶联的siRNA药物在肝脏靶向递送方面表现出色，但其复杂的结构也带来了分析上的挑战。例如，在AEX分析中，GalNAc偶联的siRNA可能与固定相发生不同的相互作用，影响其保留行为。因此，选择合适的色谱模式对于准确分析GalNAc偶联siRNA的纯度和结构至关重要。

随着siRNA药物的不断发展，分析技术也在不断进步。2D-LC、MMC、超临界流色谱（SFC）和离子迁移率光谱（IMS）等新兴技术被用于单链寡核苷酸的分析，并有望应用于siRNA的复杂结构分析。这些技术能够克服传统方法的局限性，提高分析的分辨率和准确性。

总之，siRNA药物的分析是一个复杂且多方面的过程，涉及多种LC和MS技术的综合应用。随着对siRNA药物结构和功能的深入研究，分析方法的开发和优化将成为确保其质量和疗效的关键。未来的研究应进一步探索不同色谱模式和检测技术的结合，以提高siRNA药物分析的全面性和准确性，从而支持其在临床中的广泛应用。