通过基于HPLC-MS/MS和HPLC-Orbitrap-HRMS的集成分析方法，对新型FGFR抑制剂gunagratinib在大鼠、猴子和人类肝微粒体中的代谢稳定性及代谢产物谱进行了研究

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Metabolic stability assessment and metabolite profiling of gunagratinib, a novel FGFR inhibitor, in rat, monkey and human liver microsomes by an integrated analysis method based on HPLC-MS/MS and HPLC-Orbitrap-HRMS

本研究开发并验证了基于UHPLC-MS/MS和HPLC-Orbitrap-HRMS的整合分析方法，用于枪鞍替尼在肝微粒体中的代谢评估。通过比较不同物种的肝微粒体代谢动力学，发现人/猴肝微粒体中投影肝排泄比显著高于大鼠，主要代谢途径为N-去甲基化及氧化反应，CYP3A4是主要代谢酶。该方法为药物代谢研究提供了高灵敏度和高通量的解决方案。

　　枪agratinib是一种高效的成纤维细胞生长因子受体（FGFR）抑制剂，目前正处于临床开发阶段，用于治疗头颈癌和胆管癌。尽管其在抗癌领域的潜力已被广泛认可，但关于其肝脏代谢方面的研究仍较为有限。本研究旨在开发并验证一种高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）方法，用于量化肝脏微粒体中的枪agratinib。此外，通过结合高效液相色谱与高分辨率质谱（HPLC-Orbitrap-HRMS）技术，进一步对代谢产物进行结构鉴定和代谢途径分析。这一研究不仅为药物代谢研究提供了新的方法，也为未来的临床应用奠定了基础。

FGFR属于受体酪氨酸激酶家族，包含FGFR1至FGFR5五个成员，具有高度的序列同源性。FGFR信号通路在多个基本生物过程中发挥着至关重要的作用，包括胚胎发育、血管生成、组织稳态维持以及伤口修复等。同时，该通路还调控着细胞的基本功能，如增殖、分化、程序性凋亡和迁移。FGFR的异常激活，尤其是与FGFR2基因融合，常在某些癌症中出现，如胆管癌（CCA）和头颈鳞状细胞癌（HNSCC）。因此，抑制FGFR信号通路已成为肿瘤治疗的重要策略之一。近年来，已有多种选择性FGFR抑制剂获得全球监管机构的批准，并有更多候选药物进入临床试验阶段。

枪agratinib是一种强效、口服活性、广谱FGFR抑制剂，具有较低的毒性，能够选择性且不可逆地抑制FGFR的活性。其在临床前研究中展现出克服第一代可逆FGFR抑制剂获得性耐药的能力，例如infigratinib。目前，枪agratinib正在接受针对CCA和HNSCC的临床开发。一期临床数据显示，枪agratinib在患者体内的血浆暴露量随着口服剂量的增加而成比例上升，并且表现出良好的安全性和耐受性。由于其优异的疗效，枪agratinib在2021年6月被美国食品药品监督管理局（FDA）授予孤儿药资格，用于治疗CCA。

尽管枪agratinib在实体瘤治疗中显示出良好的疗效，但在其吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性方面仍存在较大的知识空白。特别是，关于其全面的代谢特性仍不明确。药物代谢在很大程度上决定了其治疗效果，通过影响药代动力学参数（如最大血药浓度Cmax、面积下曲线AUC）以及生物半衰期，从而对药物的疗效和安全性产生深远影响。因此，在药物研发过程中，建立可靠的体外代谢模型对于预测人体内的代谢行为至关重要。

肝脏微粒体是药物代谢研究中最常用的工具之一，特别是在药物发现和开发阶段。然而，人类与动物之间在药物代谢酶的亚型组成、表达水平和催化活性方面存在显著的种属差异。这种差异可能导致动物实验结果与人体实际代谢情况不一致，进而影响药物的安全性和有效性评估。FDA的监管指南建议，在药物安全评估中应特别关注代谢产物，尤其是那些在人体中浓度远高于实验动物的代谢产物。因此，建立一种灵敏且简便的基于质谱的分析方法，对于全面评估枪agratinib的代谢特性具有重要意义。

本研究的目的是通过整合分析方法，全面表征枪agratinib的体外代谢特性。研究的主要目标包括：1）开发并验证一种简便且灵敏的HPLC-MS/MS方法，用于枪agratinib在微粒体孵育基质中的定量分析；2）利用该方法，评估枪agratinib在三种不同物种（大鼠、猴子和人类）肝脏微粒体中的代谢稳定性；3）采用HPLC-Orbitrap-HRMS技术对代谢产物的结构进行鉴定；4）提出可能的生物转化途径；5）确定参与枪agratinib代谢的P450亚型。通过这些研究，可以更深入地了解枪agratinib的代谢特性，为其临床应用提供坚实的科学依据。

在实验材料方面，枪agratinib和内标物futibatinib均购自MedChemExpress公司，其纯度均超过98%。肝脏微粒体则由Xenotech公司提供，分别来自Sprague-Dawley大鼠（雄性，50份）、人类（混合性别，150份）和恒河猴（雄性，10份）。此外，还获得了重组的人类细胞色素P450酶（CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4和3A5），用于进一步研究代谢酶的参与情况。这些实验材料的选择和准备为后续的代谢研究提供了可靠的基础。

在方法开发过程中，研究团队系统优化了分析条件，以确保方法的灵敏度和选择性。由于枪agratinib分子中含有胺基团，因此采用正离子电喷雾电离（ESI）模式进行检测，有助于形成[M+H]+离子。通过直接注入标准品到质谱离子源中，对全扫描质谱数据进行分析，以确定枪agratinib的质荷比（m/z）。这一过程为后续的定量分析和代谢产物鉴定奠定了基础。此外，通过调整流动相组成和梯度洗脱系统，确保了枪agratinib在色谱柱上的良好分离效果。梯度洗脱系统由0.1%甲酸水溶液和乙腈组成，能够在较短时间内完成高效分离，提高分析效率。

本研究中开发的HPLC-MS/MS方法具有显著的优势。首先，该方法具有较短的运行时间（2.0分钟），提高了实验效率。其次，其检测下限（LLOQ）为2 nM，表明该方法具有极高的灵敏度，能够准确检测低浓度的枪agratinib。此外，采用蛋白质沉淀法进行样品前处理，不仅简化了操作流程，还降低了样品制备过程中的复杂性，提高了实验的可重复性和可靠性。这些特点使得该方法适用于未来的临床前和临床研究，为药物代谢分析提供了新的工具。

在代谢稳定性评估中，研究团队利用肝脏微粒体分别对大鼠、猴子和人类进行了实验。结果显示，枪agratinib在大鼠中的肝脏提取率（EH）为0.39，表明其在大鼠体内的代谢较为迅速。相比之下，枪agratinib在猴子和人类中的EH分别为0.70和0.71，显示出更高的代谢稳定性。这一发现提示，在进行动物实验时，需考虑种属差异对药物代谢的影响，以更准确地预测人体内的代谢行为。此外，代谢清除率（CLH）的数据显示，枪agratinib在大鼠中的清除率为33.6 mL/min/kg，而在猴子和人类中分别为30.5 mL/min/kg和更高，进一步表明其在不同物种中的代谢特性存在显著差异。

为了进一步揭示枪agratinib的代谢机制，研究团队利用HPLC-Orbitrap-HRMS技术对代谢产物进行了结构鉴定。该技术能够提供精确的质荷比信息，帮助确定代谢产物的化学式，并通过全扫描模式和二级质谱（dd-MS2）分析，对代谢产物的碎片模式进行解析。通过这一方法，研究团队成功鉴定了七种代谢产物，并发现其中M7（N-脱甲基化产物）是最主要的代谢产物。这表明，N-脱甲基化是枪agratinib代谢的主要途径之一。此外，氧化的代谢途径也被观察到，说明枪agratinib的代谢过程涉及多种化学反应，包括脱甲基化和氧化等。

通过分析代谢产物的结构，研究团队进一步推测了枪agratinib的生物转化途径。其中，N-脱甲基化被认为是主要的代谢方式，而氧化反应则可能发生在不同的位置，如芳香环或侧链。这些代谢途径的发现有助于理解枪agratinib在体内的代谢过程，并为药物的代谢动力学研究提供理论支持。此外，通过研究不同P450亚型对枪agratinib代谢的影响，研究团队确定了CYP3A4是主要负责枪agratinib代谢的酶。这一发现对于预测药物的代谢行为和评估其在人体内的代谢稳定性具有重要意义。

本研究中，通过重组人类P450酶分析和化学抑制实验，进一步验证了CYP3A4在枪agratinib代谢中的主导作用。这些实验不仅帮助确定了主要代谢酶，还为药物代谢研究提供了新的思路。CYP3A4作为肝脏中最重要的代谢酶之一，其在药物代谢中的作用已被广泛研究。然而，针对枪agratinib的具体代谢机制，仍需进一步探索。本研究的发现为后续的代谢研究提供了基础，并有助于开发更精确的药物代谢模型。

在数据处理方面，研究团队采用了多种先进的技术手段，以提高代谢产物的鉴定准确性和实验的可靠性。这些技术包括背景扣除、质量缺陷过滤（MDF）和多重MDF（MMDF）等，能够有效去除生物基质中的干扰峰，提高代谢产物的检测灵敏度。此外，提取离子色谱图（EICs）的使用，使得代谢产物的定量分析更加精确。这些数据处理方法的结合，不仅提高了实验的效率，还增强了结果的可信度。

综上所述，本研究成功开发并验证了一种简便、灵敏的HPLC-MS/MS方法，用于枪agratinib在肝脏微粒体中的定量分析。该方法具有较短的运行时间、高灵敏度和简化样品前处理流程，适用于未来的临床前和临床研究。此外，通过HPLC-Orbitrap-HRMS技术，研究团队鉴定了七种代谢产物，并确定了N-脱甲基化和氧化的代谢途径。CYP3A4被确认为主要负责枪agratinib代谢的酶，这为理解药物的代谢机制提供了重要依据。本研究的成果不仅有助于完善枪agratinib的代谢研究，也为相关药物的开发和临床应用提供了科学支持。未来，该方法有望在更广泛的药物代谢研究中得到应用，为药物的安全性和有效性评估提供新的工具和思路。