RAF抑制剂通过直接激活GCN2激酶触发整合应激反应：肿瘤治疗中的新型脱靶效应机制解析

《Nature Communications》：RAF inhibitors activate the integrated stress response by direct activation of GCN2

本研究揭示了RAF抑制剂（RAFi）在肿瘤治疗中一个此前未被重视的脱靶效应：通过直接结合并激活激酶GCN2，驱动整合应激反应（ISR）的活化。研究人员发现，多种RAFi（如达拉非尼、维莫非尼等）可在体外和细胞内诱导GCN2自磷酸化及下游eIF2α-ATF4-CHOP通路的激活，且该过程独立于经典的ERK1/2信号通路。结构模型与点突变实验证实RAFi与GCN2激酶域直接互作，其"钟形"浓度效应曲线类似于RAFi对野生型RAF二聚体的 paradoxical activation。该发现为优化RAFi的临床应用提供了新的分子视角，提示GCN2-ISR通路可能调控肿瘤细胞应激命运决策。

　　

在肿瘤靶向治疗领域，RAF激酶抑制剂（RAFi）如达拉非尼（Dabrafenib）、维莫非尼（Vemurafenib）和恩考芬尼（Encorafenib）已被广泛应用于携带BRAF^V600E/K突变的黑色素瘤、甲状腺癌等恶性肿瘤的临床治疗。然而，这些药物在BRAF野生型（尤其是RAS突变型）肿瘤中会引发一个棘手的" paradoxical activation（矛盾激活）"现象：低浓度RAFi反而激活而非抑制RAF-ERK1/2信号通路，进而促进肿瘤生长。这一效应源于RAFi与野生型RAF二聚体的结合方式——结合一个单体后，可反式激活另一个未结合药物的单体，形成独特的"钟形"浓度-效应曲线。

值得注意的是，在探究RAFi矛盾激活现象的过程中，研究人员意外发现，多种RAFi还能诱导细胞周期阻滞和DNA复制抑制，且该效应独立于ERK1/2通路。这一现象提示RAFi可能存在未知的"脱靶"效应，可能通过其他信号通路影响肿瘤细胞命运。

为解析这一现象，英国Babraham研究所的Rebecca Gilley、Simon J. Cook团队联合邓迪大学、利物浦大学等机构，在《Nature Communications》上发表了题为"RAF inhibitors activate the integrated stress response by direct activation of GCN2"的研究论文。该研究通过高通量显微成像、RNA测序、体外激酶实验、结构建模与基因编辑等技术，系统揭示了RAFi直接激活应激感应激酶GCN2、进而启动整合应激反应（Integrated Stress Response, ISR）的全新分子机制。

关键技术方法概述

研究利用高通量显微镜（HCM）动态监测ERK1/2磷酸化（p-ERK1/2）与DNA复制（EdU标记）；通过RNA-seq筛选RAFi调控的应激通路；采用体外激酶实验验证RAFi对重组人GCN2的直接激活作用；利用CRISPR/Cas9技术构建GCN2敲除（KO）细胞系；通过点突变（如激酶死亡突变K619A、门控残基突变M802A/M802F）确认RAFi结合位点；结合分子对接模拟RAFi与GCN2的互作模式；使用选择性抑制剂（如GCN2抑制剂A-92、eIF2α拮抗剂ISRIB）进行功能挽救实验。所有细胞实验均基于人源肿瘤细胞系（如NCI-H358、HCT116、HT29）及永生化小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）。

研究结果

RAF抑制剂驱动不依赖ERK1/2的DNA复制抑制

通过EdU掺入实验发现，达拉非尼等RAFi在诱导ERK1/2矛盾激活的同时，能快速（4小时内）抑制DNA复制，且该效应在联合MEK抑制剂（Trametinib）阻断ERK1/2信号后依然存在，表明其独立于RAF-ERK1/2通路。这种快速抑制模式类似于DNA损伤应答，但未检测到p-H2AX（S139）或p-CHK1（S345）等经典DNA损伤标志物的激活。

RAF抑制剂激活不依赖PERK的整合应激反应

RNA-seq分析显示，RAFi处理显著上调内质网应激（UPR）相关基因（如ATF4、CHOP）。然而，该效应不依赖于UPR的核心传感器PERK，因为PERK抑制剂GSK2606414虽能阻断经典应激剂（衣霉素、毒胡萝卜素）诱导的ATF4/CHOP表达，却无法逆转RAFi的效应。进一步实验表明，RAFi通过激活另一eIF2α激酶GCN2（表现为其自磷酸化位点T899的磷酸化增强），驱动eIF2α（S51）磷酸化，进而促进ATF4及其下游靶点CHOP的翻译。

GCN2是RAFi诱导ISR的核心介质

使用GCN2抑制剂A-92或eIF2α拮抗剂ISRIB均可逆转RAFi介导的ATF4/CHOP上调和细胞周期阻滞。在GCN2敲除（KO）的HCT116细胞中，RAFi无法诱导ISR激活，而PERK KO细胞仍保留该响应，证实GCN2的必要性。值得注意的是，" paradox breaker"型RAFi（如PLX-8394）和pan-RAFi（如LY-3009120）同样激活GCN2，仅GDC-0879和AZ628无此效应，提示该特性普遍存在于多数RAFi。

RAFi直接结合并激活GCN2二聚体

体外实验显示，重组人GCN2可被达拉非尼、恩考芬尼等直接激活，且呈现"钟形"浓度-效应曲线（峰值在1μM），与细胞实验一致。结构模型表明，RAFi（如达拉非尼）结合GCN2激酶域后，能稳定其" Tyr-up"构象，促进背靠背二聚化及反式激活，机制类似RAFi对RAF二聚体的矛盾激活。将GCN2门控残基Met802突变为丙氨酸（M802A）后，其對达拉非尼的敏感性提高1000倍，直接证实RAFi结合激酶域。

讨论与意义

本研究系统阐明了RAFi激活ISR的全新通路：通过直接结合GCN2激酶域，诱导其二聚化及反式激活，进而磷酸化eIF2α、启动ATF4-CHOP介导的应激应答。该机制独立于RAF-ERK1/2信号，且普遍存在于多数临床RAFi中，是一种此前未被认知的"脱靶"效应。由于ISR通路由eIF2α磷酸化水平调控，RAFi对GCN2的激活可能通过抑制蛋白翻译影响肿瘤细胞存活/死亡平衡，进而干扰药物疗效或耐药性形成。

这一发现对RAFi的临床应用具有双重启示：在BRAF^V600E/K突变肿瘤中，ISR激活可能与ERK1/2抑制协同诱导细胞死亡；但在BRAF野生型肿瘤中，ISR与矛盾性ERK1/2激活的并存可能助长良性肿瘤增生。研究进一步提示，开发避免GCN2激活的RAF抑制剂（如变构调节剂）可能优化治疗窗口。该工作不仅揭示了激酶抑制剂交叉活性的新范式，也为理解肿瘤应激应答网络提供了新视角。