《Microbiology Spectrum》：A novel targeted hybrid capture-NGS assay for sensitive detection of multiplex respiratory pathogens
编辑推荐：
摘要
以COVID-19为代表的新发呼吸道传染病，以及传统呼吸道感染，对人类健康构成严重威胁。高通量测序（NGS）凭借其高灵敏度和超高通量，特别适用于检测类型极为多样且常涉及混合感染的呼吸道病原体（RP）。在本研究中，通过整合研究人员先前开发的微靶标杂交捕获（
摘要
以COVID-19为代表的新发呼吸道传染病，以及传统呼吸道感染，对人类健康构成严重威胁。高通量测序（NGS）凭借其高灵敏度和超高通量，特别适用于检测类型极为多样且常涉及混合感染的呼吸道病原体（RP）。在本研究中，通过整合研究人员先前开发的微靶标杂交捕获（MT-Capture）系统与NGS，研究人员开发了一种新型检测方法（称为RP-MT-Capture NGS），用于检测多种呼吸道病原体（超过300种/型）。通过优化探针设计和杂交捕获流程，RP-MT-Capture NGS对不同类型病原体实现了高检测灵敏度。对于流感病毒，该方法可为循环阈值（CT）值<32的样本获得血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因的全长序列，为病毒突变监测和重组分析提供了有力工具。临床样本检测结果显示，与TaqMan阵列（TaqMan array）和宏基因组NGS（mNGS）技术相比，RP-MT-Capture NGS在呼吸道病原体检测中表现出更优的准确性和灵敏度。与传统基于探针杂交的靶向NGS（tNGS）相比，RP-MT-Capture NGS将湿实验时间显著缩短至6小时内。总之，本研究开发的RP-MT-Capture NGS检测方法为检测多种呼吸道病原体提供了一种新型工具，具有重要的临床和公共卫生意义。
呼吸道感染疾病长期威胁人类健康，尤其新发呼吸道传染病（如COVID-19）与传统病原体混合感染，导致诊断困难。现有检测技术（如实时聚合酶链反应（real-time PCR））通量低，宏基因组NGS（mNGS）受宿主干扰且成本高，传统靶向NGS（tNGS）实验流程耗时长达2-3天。为此，研究人员基于先前开发的微靶标杂交捕获（MT-Capture）系统，结合NGS，开发了RP-MT-Capture NGS检测方法，旨在实现高通量、高灵敏度、快速检测超过300种呼吸道病原体，并获取流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因全长，用于突变监测。该研究发表在《Microbiology Spectrum》。关键的技术方法包括：首先，针对呼吸道病原体设计非等长MT-Capture探针（长度20-100核苷酸），避开多拷贝基因（16S rRNA、18S rRNA、内部转录间隔区（ITS）），选择约500碱基对的保守区域；其次，同步制备RNA和DNA文库，利用MT-Capture系统进行杂交捕获（2.5小时内完成），随后在Illumina NovaSeq 6000平台测序；最后，通过Burrow-Wheeler Aligner比对至人类参考基因组（hg19）和分类参考数据库，并以Unique Reads Per Million mapped reads（Unique RPM）标准化。样本队列来源为江苏省疾病预防控制中心，包括186例急性呼吸道感染（ARI）患者和50例健康对照（HC）的鼻咽拭子或痰液样本。研究结果部分：（1）RP-MT-Capture NGS的工作流程和面板设计原则：通过优化探针（避开16S等基因），湿实验时间缩短至6小时，成本低于mNGS，覆盖病原体种类多于TaqMan阵列。（2）RP-MT-Capture NGS的分析灵敏度：稀释实验显示，对乙型流感病毒、人冠状病毒OC43、人α疱疹病毒（CT值≥33）、肺炎克雷伯菌（CT值36）和铜绿假单胞菌（CT值34）均能检出，证明高灵敏度。（3）流感病毒的高精度分型和HA/NA基因全长检测：该方法准确鉴定流感病毒亚型（如H5N1、H7N9），并对CT值<32的样本实现HA和NA基因100%覆盖，系统发育分析显示H1N1 HA基因属于clade 6B.1A，H3N2 HA基因属于clade 3C.2a1b.2。（4）RP-MT-Capture NGS的临床样本分析：186例ARI样本检出64种病原体，包括14种革兰氏阳性菌、13种革兰氏阴性菌、8种真菌、9种DNA病毒、18种RNA病毒、1种支原体和1种衣原体。对7种机会致病菌在HC和ARI样本中的比较显示，部分病原体在ARI样本中相对丰度更高，但检出率可能受其他病原体抑制。（5）RP-MT-Capture NGS相比TaqMan阵列和mNGS具有更优准确性和灵敏度：在159例样本中，RP-MT-Capture NGS检出率（95.97%）高于TaqMan阵列（84.56%），且对多数共检病原体阳性样本数更多；mNGS对病毒检出率为73.1%，细菌为100%，真菌为0%，而RP-MT-Capture NGS的病毒富集倍数达463-11,801。讨论部分总结：RP-MT-Capture NGS通过避免多拷贝基因增强了RNA病毒检测，且通过探针更新可灵活扩展检测面板，成本约70美元/样本。对于机会致病菌，需结合临床与相对丰度判断致病性。局限性包括面板对部分病原体（如鼻病毒>120血清型）覆盖不全，样本量较小且来自单中心。研究结论翻译：总之，本研究开发的RP-MT-Capture NGS检测方法为检测多种呼吸道病原体提供了一种新型技术工具，它能够同时检测大多数常见呼吸道病原体，具有重要的临床和公共卫生意义。
