一种新型的靶向混合捕获-下一代测序（NGS）检测方法，用于灵敏地检测多种呼吸道病原体

《Microbiology Spectrum》：A novel targeted hybrid capture-NGS assay for sensitive detection of multiplex respiratory pathogens

呼吸道感染检测新方法RP-MT-Capture NGS整合微靶标杂交捕获与NGS，可同步检测300余种病原体。优化探针设计实现CT值<32时流感HA/NA全基因捕获，临床验证显示其检测准确率（95.97%）显著高于TaqMan阵列（84.56%），检测时间压缩至6小时，兼具高灵敏度和成本效益优势，为呼吸道多病原检测提供创新工具。

　　近年来，呼吸系统传染病已成为全球公共卫生领域的重大挑战。这些疾病不仅包括新型的如新冠病毒（SARS-CoV-2）和严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）等，也涵盖了传统呼吸道病原体，如流感病毒、腺病毒、肺炎支原体等。由于这些病原体种类繁多，且常常在同一个患者体内同时感染，因此，开发一种能够高效、快速且准确检测多种呼吸道病原体的技术显得尤为重要。本研究通过整合一种新型的微靶向杂交捕获系统（Micro-Targets Hybrid Capture, MT-Capture）与高通量测序技术（Next-Generation Sequencing, NGS），成功开发出一种名为RP-MT-Capture NGS的新检测方法，能够同时识别超过300种呼吸道病原体，并且在流感病毒的检测中，还能获取完整的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因序列，从而为病毒变异监测和重组分析提供了可靠的工具。该方法不仅在检测灵敏度和准确性方面优于现有的TaqMan探针阵列和宏基因组测序（mNGS）技术，还大幅缩短了实验操作时间，将湿实验流程控制在6小时以内，为临床诊断和公共卫生防控提供了重要的技术支持。

呼吸系统感染的高发性和高致死率使其成为全球公共卫生关注的焦点。随着全球化的加速，新型呼吸道传染病不断出现，如SARS、MERS、高致病性禽流感病毒（如H5N1、H7N9）以及2019冠状病毒病（COVID-19）。这些疾病的发生与人口流动加快、抗生素滥用、环境污染以及病原体的突变和进化密切相关。此外，传统的呼吸道病原体如流感病毒、腺病毒、肺炎支原体等也经常引发感染和疫情。尤其是在新冠疫情之后，由于人们免疫保护水平的下降，常见呼吸道感染的发病率显著上升。这使得快速、全面和准确的病原体诊断成为应对这些疾病的关键。早期准确的病原体识别不仅有助于选择敏感的治疗方案，还能及时采取有效的预防和控制措施，从而降低疾病的传播风险和患者的死亡率。

传统的实验室诊断方法，包括病原体培养、生化检测和免疫学检测，虽然在某些情况下仍然适用，但普遍存在操作复杂、耗时长以及灵敏度低的问题。例如，抗体检测技术在感染初期存在“窗口期”，即从初次感染到能够可靠检测之间的时期，这限制了其在早期诊断中的应用。尽管近年来核酸扩增技术（Nucleic Acid Amplification Test, NAAT）因其快速、高灵敏度和特异性而成为病原体检测的重要工具，但其通常只能在一个反应管中检测4至6种病原体，难以满足多病原体混合感染的检测需求。因此，开发一种能够同时检测多种呼吸道病原体的高通量技术成为迫切需求。

高通量测序技术，特别是宏基因组测序（mNGS）和靶向测序（targeted NGS, tNGS），为病原体检测提供了新的解决方案。mNGS能够识别样本中存在的所有病原体，但由于宿主基因组数据量庞大，可能会干扰病原体的检测灵敏度。相比之下，tNGS通过聚焦于特定的临床相关靶点，提高了检测速度、灵敏度和成本效益。然而，基于PCR扩增的tNGS方法存在一定的局限性，如PCR扩增过程中的偏差、引物对的高数量导致的引物二聚体或多重引物形成的干扰，以及Taq酶在扩增过程中可能引入的错误，这些都会影响检测的准确性。此外，由于引物更新滞后，基于PCR的扩增方法在检测新出现的病原体变异时可能存在局限。

为了解决传统液相杂交捕获方法耗时长、操作繁琐的问题，我们之前的研究开发了一种新型的快速高效的微靶向杂交捕获系统（MT-Capture），并将其成功应用于新冠病毒全基因组测序。尽管呼吸系统多病原体捕获测序与全基因组测序在目标选择上有所不同，但它们的实验流程，特别是杂交捕获过程，具有一定的相似性。因此，在本研究中，我们整合MT-Capture技术与NGS，开发出了一种新的检测方法——RP-MT-Capture NGS。通过优化探针设计和杂交捕获流程，RP-MT-Capture NGS实现了对不同类型病原体的高灵敏度检测。对于流感病毒，该方法能够获取CT值小于32的样本中HA和NA基因的全长序列，为病毒变异监测和重组分析提供了可靠工具。临床样本检测结果表明，RP-MT-Capture NGS在检测多种呼吸道病原体方面表现出更高的准确性和灵敏度，相较于TaqMan阵列和宏基因组测序技术，具有显著优势。与传统的基于探针杂交的靶向测序技术相比，RP-MT-Capture NGS将湿实验操作时间缩短至6小时内，极大地提高了检测效率。

在RP-MT-Capture NGS的开发过程中，探针设计是关键环节之一。考虑到呼吸道病原体的多样性和复杂性，我们优先选择高度保守的基因区域作为探针设计的目标。这一策略不仅降低了探针成本，还提高了病原体捕获的效率。对于RNA病毒，由于其保守区域较少，我们建议选择流行的病毒株作为参考基因组，并适度增加探针密度以提高捕获效率。然而，某些基因如16S rRNA、18S rRNA和内转录间隔（ITS）区域虽然常用于细菌和真菌的鉴定，但其多拷贝特性可能不适合作为RP-MT-Capture NGS的检测目标。例如，设计针对16S rRNA的探针可能会捕获更多的核糖体靶标，从而影响低丰度病原体的检测率。实验结果证实了这一假设，因此我们选择了除16S、18S和ITS以外的其他病原体特异性基因作为探针设计的依据。这一策略有助于提高RNA病毒的检测效率，同时确保细菌和真菌的准确识别。

RP-MT-Capture NGS在分析灵敏度方面表现出色。通过对不同病原体的临床样本进行连续稀释，并使用该方法进行检测，我们成功识别了CT值大于等于33的流感B病毒、人类冠状病毒OC43和人类疱疹病毒。此外，该方法还能检测到CT值为36的肺炎克雷伯菌和CT值为34的铜绿假单胞菌。这些结果表明，RP-MT-Capture NGS具有较高的分析灵敏度，能够检测到低丰度的病原体。在流感病毒的检测中，该方法能够获取HA和NA基因的全长序列，这对于监测病毒变异和重组具有重要意义。通过与实时PCR的对比分析，我们发现RP-MT-Capture NGS在大多数情况下都能准确识别流感病毒亚型，并且在CT值低于32的样本中，HA和NA基因的覆盖率达到100%。这表明该方法在病毒变异追踪方面具有显著优势。

在临床样本分析中，RP-MT-Capture NGS被用于检测186例急性呼吸道感染（ARI）患者的样本。结果表明，共有64种不同的病原体被检测到，包括14种革兰氏阳性菌、13种革兰氏阴性菌、8种真菌、9种DNA病毒、18种RNA病毒、1种支原体和1种衣原体。其中，最常见的是嗜血杆菌、链球菌和流感嗜血杆菌等细菌，以及人β疱疹病毒7（玫瑰疹病毒）、人γ疱疹病毒4（EB病毒）、鼻病毒、流感A病毒H3N2和新冠病毒等病毒。在健康对照组（HC）样本中，也检测到了七种机会性病原体，其检测率接近或超过50%。进一步的比较分析显示，这些机会性病原体在ARI样本中的检测率与HC样本相比并未显著提高，甚至在某些情况下更低，这表明在某些ARI患者中，其他特定病原体的感染可能抑制了这些机会性病原体的定植。此外，检测结果还显示，这些病原体在部分ARI样本中的相对丰度显著低于HC样本，但总体上，其丰度分布范围更广，且阳性样本的平均病原体载量更高。这表明，某些病原体如肺炎链球菌、咽峡炎链球菌和流感嗜血杆菌可能在免疫功能下降的情况下发生二次增殖，从而导致疾病的发生。因此，在解读机会性病原体的阳性结果时，必须结合临床表现和病原体的相对丰度，以判断其潜在致病性。

与TaqMan阵列和mNGS相比，RP-MT-Capture NGS在检测呼吸道病原体方面展现出更高的准确性和灵敏度。在对159例ARI样本进行平行分析时，RP-MT-Capture NGS的检测率为95.97%，而TaqMan阵列仅为84.56%。在共检出的17种病原体中，RP-MT-Capture NGS在大多数情况下检测到的阳性样本数量显著高于TaqMan阵列。此外，对于某些特定的病原体，如人类冠状病毒HKU1和肺炎支原体，TaqMan阵列在低病毒载量样本中表现更优。这表明，尽管RP-MT-Capture NGS在大多数情况下具有更高的检测能力，但在某些特定条件下，TaqMan阵列仍有一定的优势。

在与mNGS的比较分析中，我们选择了38例在RP-MT-Capture NGS检测中表现出较高病原体载量的样本进行mNGS分析。结果表明，mNGS在病毒检测中的检出率为73.1%，而在细菌检测中的检出率为100%，而真菌的检出率为0%。相比之下，RP-MT-Capture NGS在病毒和细菌检测中均表现出更高的灵敏度。此外，RP-MT-Capture NGS的病毒富集倍数范围在463至11,801之间，进一步验证了其在病毒检测中的优势。然而，该方法仍存在一定的局限性，例如，其检测能力依赖于设计的呼吸道病原体面板（RP panel），无法覆盖所有病原体。例如，对于超过120种血清型的鼻病毒，RP panel可能无法识别所有亚型。这一问题与探针覆盖的目标区域大小以及数据库中参考基因组的注释有关。未来，通过增加探针密度或优化数据库注释，可以进一步提高对多型病原体（如鼻病毒）的检测覆盖率。

此外，RP-MT-Capture NGS的临床评估基于相对较小的样本量，且主要来自单一研究机构，这可能影响研究结果的代表性和普适性。目前，我们已经开始在多个研究中心进行该方法的验证，以确保其稳健性。最后，本研究中采用的库制备和MT-Capture流程仍需人工操作，涉及多个实验步骤，这可能导致实验时间较长和人为误差。未来，通过自动化库制备仪器实现流程的自动化，将有助于进一步缩短实验时间、减少人为误差并提高结果的稳定性。

综上所述，本研究开发的RP-MT-Capture NGS检测方法为多种呼吸道病原体的检测提供了一种新的技术工具。该方法不仅能够同时检测大多数常见的呼吸道病原体，还在病毒变异监测和重组分析方面具有显著优势。尽管该方法仍存在一些局限性，如对某些病原体的检测能力受限和样本量较小，但其在临床诊断和公共卫生防控中的应用前景广阔。未来，随着探针设计的优化和自动化技术的发展，RP-MT-Capture NGS有望成为呼吸道病原体检测的首选方法之一。