低温储存对传代软骨细胞存活率及重分化潜能的影响

《Current Therapeutic Research》：The Effects of Hypothermic Storage on Passaged Chondrocyte Viability and Redifferentiation Potential

本研究探讨低温储存对自体软骨细胞移植的影响，发现悬浮低温储存虽抑制增殖但促进红分化及基质沉积，与原假设相反，提示低温可能有益于ACI。

　　

Dilpreet Rayat | Jack Miller | Stephanie Richardson-Solorazano | Rylee E. King | Valerie C. West | Alvin W. Su | Justin Parreno

特拉华大学生物科学系，特拉华州

摘要

自体软骨细胞移植（ACI）是一种基于细胞的疗法，用于治疗局部关节软骨缺损。在ACI过程中，从非承重健康软骨区域分离出软骨细胞，并将其送往细胞制备实验室，在那里通过单层培养扩增细胞数量。扩增后的细胞随后被运输回诊所，重新植入缺损部位。从细胞制备设施到诊所植入过程中的储存和运输条件可能会影响修复效果。然而，关于急性低温储存对经过传代处理的软骨细胞的影响（人们认为低温可以保持细胞活力）目前尚不完全清楚。本研究测试了以下假设：急性低温储存会对经过传代处理的软骨细胞活力产生负面影响，并降低其再分化能力。

经过传代处理的软骨细胞被分别储存在36°C、19°C或8°C的单层培养液或悬浮液中。在单层培养中，低温能够保持细胞活力，促进细胞圆润化，减少细胞增殖，分解丝状肌动蛋白，并降低特定基质分子的mRNA水平（与36°C相比）。低温的影响取决于具体条件。在悬浮液中，低温处理可以提升细胞活力并减少细胞聚集。在8°C下，悬浮液中的细胞增强了特定基质分子的mRNA表达。随后，当这些细胞在琼脂糖模具中以三维形式培养时，聚集蛋白的表达增加，形成了更厚的组织。因此，与我们的假设相反，研究发现低温储存并未产生负面影响；在悬浮液中储存1天后，其对基质沉积有长期影响。因此，低温储存条件可能对ACI有益，值得进一步研究其在体内修复中的应用。

引言

自体软骨细胞移植（ACI）是一种用于治疗局部软骨损伤的细胞移植疗法[[1], [2], [3]]。在ACI过程中，首先通过关节镜手术从患者关节的非承重区域获取健康软骨，然后将其送往细胞制备实验室。在实验室中，从获取的软骨组织中分离出软骨细胞，并通过单层（二维，2D）培养扩增细胞数量。当获得足够数量的细胞后，这些细胞会被运输到诊所进行手术植入。ACI的成功部分取决于能否移植出能够生成软骨修复组织的存活细胞[4]。

细胞所处的培养环境对其活力和软骨基质生成能力起着关键作用。虽然将软骨细胞在硬质聚苯乙烯上培养可以促进细胞增殖并生成大量细胞，但单层培养也会导致细胞去分化。在去分化过程中，软骨细胞形态发生变化，变得扁平且面积增大[5]。此外，软骨细胞通过将丝状肌动蛋白从皮质结构重组为应力纤维结构来改变其细胞骨架[[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]]。这种形态和细胞骨架的变化会导致基质分子表达失调。与表达II型胶原（Col2）和聚集蛋白（Acan）等软骨基质分子不同，单层扩增后的软骨细胞会表达I型胶原（Col1）和Tenascin C（Tnc）等纤维基质分子，从而生成生物力学性能低于关节软骨的纤维软骨[8,12]。此外，经过传代处理的软骨细胞还会产生收缩性分子，如α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）和transgelin（TAGLN）[[13], [14], [15]]。这些收缩性分子的表达会增加组织的收缩性，可能影响组织整合。由于单层培养环境导致的细胞去分化可能会影响ACI的治疗效果。

除了单层培养外，软骨细胞的低温储存也是影响细胞健康和基质生成能力的一个因素。在单层扩增过程中，细胞通常在设定为生理体温（约37°C）的标准细胞培养箱中培养。然而，在细胞扩增后，它们会被运输回诊所，通常以悬浮液形式在低于生理体温的温度下储存。目前关于急性短期低温储存对经过传代处理的软骨细胞的活力、表型和基质生成能力的影响了解有限。总体而言，低温培养条件被认为是不利的。例如，将山羊软骨组织储存在4°C[16]或人类软骨盘储存在22°C[17]下会降低细胞活力；将鼻软骨细胞在32.2°C下培养会减缓细胞增殖[18]；在32°C下培养原代软骨细胞会减少沉淀物中的糖胺聚糖积累[19]；长期在32°C下培养经过传代处理的软骨细胞会抑制其再分化能力[20]。其他类型细胞的研究也表明，较低温度同样会损害非软骨细胞的活力和健康[21]。

由于目前关于急性短期低温对经过传代处理的软骨细胞具体影响的知识有限，我们试图验证以下假设：在低温下储存经过传代处理的软骨细胞会对细胞造成损害，导致细胞死亡增加，并降低其软骨生成表型和基质生成能力。

部分内容摘要

软骨细胞的分离与扩增

我们从当地肉店获取了牛的掌指关节组织。在无菌条件下，使用手术刀从关节中刮取全层关节软骨。首先在CO₂培养箱中用0.5%的Streptomyces griseus（P5147；Sigma-Aldrich；美国马萨诸塞州伯灵顿）来源的蛋白酶消化1小时，然后使用0.1%的胶原酶（Roche；美国马萨诸塞州布鲁林顿）消化过夜。消化后的组织通过过滤装置进行分离...

储存环境的温度评估

为了确定平均储存温度及随时间变化的温度波动情况，我们测量了细胞培养箱、实验室环境及冰箱内的温度。使用高精度温度记录仪记录24小时内的数据，发现培养箱、实验室环境和冰箱内的温度分别为36.03±0.06°C（平均值±标准误差）、19.42±0.06°C和7.81±0.09°C（图S1A）。我们仅观察到轻微的温度变化...

讨论

本研究原本假设在低温下储存经过传代处理的细胞会对其活力、再分化能力和基质生成能力产生负面影响。然而，研究结果与这一假设相反。我们发现，在低温下培养细胞长达三天并未对单层或悬浮培养中的细胞活力产生负面影响。相反，低温储存反而...