一种用于多尺度数据融合的计算框架，用于评估微塑料和纳米塑料与人类肝脏毒性之间的关联

《Environment International》：A computational framework for multi-scale data fusion in assessing the associations between micro- and nanoplastics and human hepatotoxicity

微纳米塑料（MNPs）作为新型环境污染物，其肝毒性机制及风险评估亟待系统研究。本研究构建了整合多源异构数据和肝毒性基因网络的计算框架，通过基因-通路-毒性终点的多层级分析，量化评估了11类MNPs与7种肝毒性终点的关联强度。结果显示，PS、PTFE-PMMA、PP、PHA、PHB、PMMA和PE具有强肝毒性关联（综合得分≥0.40），其中PS关联性最强（0.71），主要涉及氧化应激、代谢紊乱、炎症及肝纤维化；而PVC、PEVA、PA和PLA关联性较弱。关键机制包括“非酒精性脂肪肝”和“化学致癌-活性氧”通路的协同作用，提示MNPs通过多靶点、多通路机制引发肝损伤。本研究为MNPs的毒性分级和精准风险评估提供了新范式。

　　微塑料（Micro- and Nanoplastics, MNPs）作为一种新型环境污染物，近年来引起了广泛的关注。随着塑料制品的广泛使用和大量废弃，MNPs污染已成为全球性的环境问题。微塑料通常指直径小于5毫米的塑料颗粒或碎片，而纳米塑料则是进一步破碎后形成的直径小于100纳米的微塑料（Stapleton, 2021）。这些微小的塑料颗粒在海洋、大气、沉积物以及各种生态系统中普遍存在，并通过多种途径进入生物体。它们的积累引发了对生态系统稳定性和人类健康潜在风险的担忧（Luo et al., 2024；Thompson et al., 2004）。来自陆地的废弃物和海洋活动产生的微塑料被洋流携带，形成跨洋污染带，其影响范围远超原始来源（Bergmann et al., 2017）。大气中的MNPs主要来源于塑料老化、轮胎磨损和工业排放，可通过空气流动远距离传输，甚至跨越大陆和海洋（Allen et al., 2021；Evangeliou et al., 2020）。许多海洋生物，如浮游动物、贝类和鱼类，能够摄取MNPs，这些MNPs随后通过食物链转移到更高营养级的生物体内（Toussaint et al., 2019）。对于人类而言，主要的MNPs暴露途径包括饮食摄入和吸入（Li and Liu, 2024；Wright and Kelly, 2017）。皮肤接触个人护理产品中的MNPs也是另一种暴露方式（Chang et al., 2020）。研究表明，MNPs能够穿过肠道进入血液，并在肝脏、大脑等器官中积累（Zheng and Wang, 2024；Zhi et al., 2025）。这种生物累积可能导致炎症反应和组织损伤（Zheng and Wang, 2024；Zhi et al., 2025）。尽管关于人体内MNPs的研究仍处于初步阶段，但已有研究发现MNPs在人体组织如胎盘和心脏中存在（Ragusa et al., 2021）。这些发现突显了MNPs对人体健康可能带来的潜在危害。

肝脏是维持机体系统稳态的重要器官，具有代谢、解毒和胆汁分泌等多种功能。研究表明，MNPs具有引发一系列肝毒性效应的潜在风险，包括氧化应激、炎症反应、肝纤维化和肝细胞死亡（Romano et al., 2020；Wang et al., 2023a；Wei et al., 2024；Yin et al., 2023）。在动物模型中，MNPs暴露可诱导肝脏氧化应激，表现为丙二醛（MDA）和过氧化氢（H?O?）水平升高，伴随超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性显著增强（Romano et al., 2020）。在MNPs诱导的氧化应激过程中，核因子E2相关因子2（Nrf2）的表达受到抑制，而微RNA-26a（miR-26a）的表达则被上调。这些变化促进了炎症因子如核因子-κB p65（NF-κB p65）向细胞核转移，加速肝纤维化的进程（Wei et al., 2024）。此外，研究还发现，MNPs暴露可增加白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的表达水平，这进一步加剧了肝细胞的炎症反应（Yin et al., 2023）。另一项研究指出，MNPs可能通过上调脂肪酸转运蛋白Fatp2的表达来促进肝脏脂质积累（Wei et al., 2024）。这一过程可能导致肝脏脂质代谢紊乱。还有研究显示，单独暴露于MNPs可诱导肝细胞发生铁死亡（ferroptosis），其特征包括脂质过氧化和铁积累（Wang et al., 2023a）。此外，研究还发现，MNPs可下调金鱼肝脏中的胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP-1）和生长激素（GH）受体基因的表达，表明MNPs可能通过影响生长调控轴来抑制鱼类肝脏的生长（Romano et al., 2020）。

目前，关于MNPs对肝脏潜在危害的研究仍处于早期阶段。现有证据主要来源于特定模式生物或单一毒性指标的研究，缺乏系统性、多尺度的机制分析和全面的风险评估。为此，本研究开发了一种高效的计算毒理学框架，整合多源异构数据和肝毒性基因网络，以评估MNPs与人类肝毒性的关联。该框架实现了从基因组数据、通路扰动到具体毒性终点和整体肝毒性层面的多层次综合分析。多维信息包括跨物种基因组数据、文献中的通路数据以及权威数据库中的肝毒性通路数据。通过构建定量的连接评分矩阵，系统评估了11种代表性MNPs与7种人类肝毒性终点的关联程度。提出了一个综合肝毒性评分作为评估指标，用于衡量每种MNPs与人类肝毒性之间的整体相关程度。此外，还结合转录组学实验，以阐明MNPs诱导肝毒性的机制。

本研究的数据收集过程涉及对Web of Science（WoS）数据库中过去十年关于MNPs毒性的文献进行系统检索。使用布尔运算符组合搜索关键词，如“micro- and nanoplastics”、“micro/nanoplastics”、“microplastic”、“nanoplastic”以及“toxicity”、“toxicology”等，最终筛选出35种MNPs，其中聚苯乙烯（PS）是最常被引用的代表性材料。这些MNPs被选为后续文献检索的关键词，以扩展关于MNPs肝毒性的数据收集范围。系统检索在WoS数据库中进行，截止至2024年5月15日。收集了与MNPs诱导肝毒性相关的基因表达和通路数据。在检索过程中未对语言、文献类型或发表年份进行限制，但排除了预印本、通讯、编辑部来信以及无摘要的文献。最终收集了607篇相关文献。

本研究通过R语言中的biomaRt包从Ensembl数据库中获取了基因集及其注释信息，基于物种间的基因同源性，筛选出14个具有“一对一”同源关系的基因表，用于将实验动物基因映射到人类同源基因。通过这种方式，确保了后续分析的可靠性，减少了“一对多”或“多对多”映射可能引入的偏差。最终识别出394个人类相关基因，并通过分析179篇保留文献，对11种不同类型的MNPs对基因表达和功能的调控效应进行了全面分析。根据MNPs分类，将394个相关基因进行细致分类，以明确MNPs与基因之间的相互作用关系（图1A，表S3）。

在构建肝毒性基因网络方面，本研究利用TG-GATEs的毒基因组数据，通过R语言中的WGCNA分析方法构建了肝毒性基因网络。该网络包含了206,261个基因-基因相互作用。通过计算网络中各基因之间的相关性，并设定0.05的权重值（相关性）作为筛选标准，确保了网络的稳健性（表S5）。这一网络为后续分析提供了可靠的基因组水平证据。

为了识别和扩展MNPs与基因的相互作用，本研究采用随机游走重启（RWR）算法，模拟由MNPs-基因相互作用引发的基因-基因交互链。RWR算法在预测相关基因方面已被证明具有高度准确性和效率（Li et al., 2018；Lu et al., 2017；Zhang et al., 2018）。该算法通过在基因网络中进行随机游走，计算从起始节点到达各个节点的概率，从而反映节点间的接近度和相关性。计算出的概率被称为RWR评分（Can et al., 2005；K?hler et al., 2008）。通过RWR算法，对每个MNPs的基因组数据进行排序，生成优先级基因列表，其中排名前1000的基因被选为关键相关基因。这些基因被认为与MNPs的肝毒性密切相关。通过整合这些关键相关基因，有效扩展了MNPs与基因之间的相互作用。每种MNPs扩展的关键相关基因集用于通路富集分析（表S6）。

本研究进一步通过KEGG、REACTOME和WikiPathways等数据库对关键相关基因集进行了通路富集分析，并结合文献中的通路数据，构建了11种MNPs与肝毒性相关的通路集（表S7）。肝相关通路被从KEGG、REACTOME、WikiPathways和PathCards数据库中收集。其中，与七个预定义肝毒性终点相关的通路被保留为肝毒性关键通路集（表S8）。通过通路重叠分析，识别出62至207个共享通路，其中22个通路在超过15次重叠事件中出现（图1B）。基于这些重叠结果，计算了11种MNPs与七个肝毒性终点之间的连接评分矩阵，并提出了综合肝毒性评分作为评估指标。该评分系统用于衡量MNPs与肝毒性之间的关联程度，评分越高，表明关联越强。通过通路重叠模式，构建了连接评分矩阵和综合肝毒性评分，以量化MNPs与毒性终点的关系。这些定量指标用于评估MNPs与肝毒性的关联程度，评分越高，表明关联越强（图1C）。

在实验动物的处理和分组方面，本研究选取了18只8周龄的雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，购自北京华福生物科技有限公司。在通风笼中适应7天后，将大鼠随机分为对照组（n=6）、PS处理组（n=6）和PE处理组（n=6）。PS处理组和PE处理组分别通过每日灌胃暴露于PS-MPs或PE-MPs，剂量为1325 mg/kg/day。该剂量参考了人类报告的最坏情况MNPs暴露水平。Tang等报道，成人摄入的最坏情况MNPs摄入量范围为11.5至23.7 mg/kg/day，而吸入暴露则达到20.2 mg/kg/day，合计上限为43.9 mg/kg/day（Cox et al., 2019；Tang et al., 2024）。考虑到人类与实验动物之间的种间差异，通常采用100倍的不确定性因子进行种间外推。该不确定性因子用于从动物研究中生成人类暴露的安全值或参考剂量，代表风险评估中的标准做法（Tang et al., 2024；US Epa, 2023；Walton et al., 2001）。该不确定性因子通常是两个十倍因子的乘积，一个用于种间差异，一个用于人类变异。将1325 mg/kg/day的MNPs暴露剂量施加给大鼠，相当于人类暴露剂量约13.25 mg/kg/day，该剂量仍处于人类最坏情况MNPs暴露上限范围内。Lee等使用了相同浓度的2000 mg/kg/day PE MPs进行ICR小鼠的重复灌胃实验（Lee et al., 2022）。同时，Ebrahim等报告PS NPs的LD50为2500 mg/kg/day（Ebrahim et al., 2024）。因此，选择1325 mg/kg/day的剂量以确保人类等效剂量在人类最坏情况MNPs暴露上限范围内。

对照组大鼠接受了等体积的玉米油载体（10 mL/kg），与处理组保持相同的7天暴露时间。所有大鼠在最后一次给药后24小时被处死，从每组中选取3只大鼠的肝脏组织，并将其在-80℃下冷冻以供进一步分析。

在转录组测序和功能富集与注释分析方面，本研究从大鼠肝脏组织中提取总RNA，并进行了RNA-seq实验。RNA质量通过5300 Bioanalyzer（Agilent）测量，RNA数量通过ND-2000（NanoDrop Technologies）测定。在Majorbio公司，使用Illumina NovaSeq X Plus平台进行了配对末端RNA-seq（2×150 bp）实验。基因表达水平通过每百万转录物数（TPM）计算，以确定对照组、PS处理组和PE处理组的基因表达谱。RSEM用于量化基因丰度，而基于负二项分布的DESeq2软件用于差异表达分析。差异表达基因（DEGs）的鉴定标准为倍数变化大于1.5且p值小于0.05。通过GO和KEGG数据库对DEGs进行功能富集和注释分析，以阐明相关基因及其通路的生物学功能。清洁的读数存储在NCBI Sequence Read Archive（SRA accession: PRJNA1198684）中。

研究结果表明，本研究提出的计算毒理学框架整合了多源异构数据和肝毒性基因网络，为系统评估MNPs与肝毒性之间的关联提供了创新的范式。通过构建MNPs与毒性终点的多维关联矩阵模型，该方法不仅实现了对多种MNPs肝毒性风险的直观评估，还促进了对特定毒性终点的深入研究。同时，该框架为其他污染物的毒理学评估提供了新的视角和方法。研究结果显示，PS、PTFE-PMMA、PP、PHA、PHB、PMMA和PE与肝毒性具有强关联，而PVC、PEVA、PA和PLA则显示出较弱的关联。此外，氧化应激、肝纤维化、代谢和炎症这四个终点与MNPs存在密切关联。

在进一步分析MNPs与肝毒性之间的关联时，本研究发现，这些MNPs主要影响与氧化应激、肝纤维化、代谢和炎症相关的通路。通过分析，识别出多个关键通路，包括“非酒精性脂肪肝病”、“化学致癌-活性氧物种”、“胆固醇代谢”和“类固醇生物合成”。这些通路在不同MNPs的基因集和肝毒性关键通路集中被显著富集。例如，PS处理组的DEGs主要富集于“非酒精性脂肪肝病”、“化学致癌-活性氧物种”、“胆固醇代谢”等通路，而PE处理组的DEGs则主要富集于“类固醇生物合成”、“组胺代谢”、“花生四烯酸代谢”等通路（图7和图8）。这些结果表明，PS和PE对肝脏相关通路的调控具有显著影响，进一步验证了其对肝脏健康的潜在危害。

本研究的计算框架部分克服了“种间屏障”和“数据孤岛”的限制，整合了多维数据。通过构建特定肝毒性终点的连接评分矩阵，并计算每种MNPs的综合肝毒性评分，实现了从基因和通路到毒性终点和整体毒性的多层次分析。这一系统性策略显著增强了对MNPs潜在肝毒性机制的理解深度和广度。数据驱动的定量评估方法不仅为MNPs相关肝毒性研究提供了高效、系统的研究工具，还为评估其他环境污染物的毒性提供了新视角。通过将复杂的基因和通路信息转化为直观的评分矩阵，该框架能够快速识别高风险环境污染物，并确定有价值的实验验证目标。