综述：液体活检在肺癌筛查中的原理、进展、机遇与挑战

《Clinical and Experimental Medicine》：Liquid biopsy in lung cancer screening: rationale, progress, opportunities and challenges

本综述系统阐述了液体活检在肺癌（LC）筛查中的应用价值，重点评估了循环肿瘤DNA（ctDNA）、蛋白质和代谢物等多种生物标志物的生物学相关性、预测准确性及检测技术，并探讨了如何通过成本效益分析将其整合到常规临床实践中以改善肺癌预后的未解问题，为未来肺癌筛查方法的开发及液体活检的临床转化提供了重要见解。

　　

背景

肺癌（Lung Cancer, LC）是全球癌症相关死亡的主要原因，2020年估计有220万新发病例和180万死亡病例。尽管近年来由于烟草控制，肺癌发病率有所下降，但生存率的改善缓慢，部分原因是大多数患者在晚期才被诊断。目前，低剂量计算机断层扫描（Low-Dose Computed Tomography, LDCT）被大多数指南推荐用于高危人群的肺癌筛查，高危人群定义为50-74岁、有当前或既往长期吸烟史的个体。然而，LDCT筛查存在若干局限性，例如因对良性结节特异性较低（约60%）而导致的过度诊断和过度治疗，以及潜在的辐射暴露风险。在美国，仅有2%至4%符合LDCT筛查条件的个体报告接受了筛查。因此，开发和应用准确、非侵入性的肺癌筛查方法势在必行。

肺癌的发生涉及多种病理过程，包括基因突变、表观遗传改变、旁分泌信号失调和肿瘤微环境重塑。虽然组织标本仍然是获取肿瘤源性核酸的“金标准”材料，但血液、腹水、脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）、胸水、唾液和尿液等体液通过一种称为液体活检的侵入性较小的程序，为肿瘤的早期诊断和预后提供了新的见解。自2020年以来，液体活检在实体瘤，尤其是肺癌中的应用迅速发展，已有两种新的FDA批准的综合基因组分析液体活检检测方法。本综述综合了液体活检在肺癌筛查中的进展，并对不同类别生物标志物的生物学意义、预测效率和检测技术进行了比较分析。我们还讨论了这一快速发展的领域中的开放问题和未来方向。

用于肺癌筛查的生物标志物

目前，快速发展的生物标志物主要包括循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）突变、ctDNA甲基化、细胞游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）片段化、微小RNA（microRNAs, miRNAs）、肿瘤相关自身抗体（Tumor-Associated Autoantibodies, AAbs）和代谢物。我们总结了不同类型生物标志物在肺癌筛查中的特点，并从生物学特性、检测方法、临床应用、当前筛查性能到局限性等方面对这些生物标志物进行了介绍。

循环肿瘤细胞（CTCs）

在肿瘤发展过程中，肿瘤细胞可能通过主动或被动迁移、侵袭从原发或转移肿瘤部位进入血液循环系统，这些细胞被称为循环肿瘤细胞（CTCs）。由于通过上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transformation, EMT）或非EMT介导的机制，上皮细胞粘附因子（Epithelial Cell Adhesion Molecule, EpCAM）的表达降低，CTCs比正常细胞更具移动性和侵袭性。由于CTCs保持了肿瘤细胞的完整性，它们可以提供肿瘤细胞的形态学、基因组信息和蛋白质表达信息。

CTCs检测的关键是从正常白细胞（White Blood Cells, WBCs）中分离CTCs。根据CTCs的物理特性（大小、密度、弹性）、生物学特性（上皮细胞粘附分子、特异性抗体、酶）和材料特性，已经开发了多种技术来改进CTCs检测。这些技术可分为抗原依赖性和抗原非依赖性方法，分别以CellSearch?系统和基于肿瘤细胞大小的分离技术（Isolation by SizE of Tumor Cells, ISET?）为代表。CellSearch使用与EpCAM特异性单克隆抗体偶联的铁流体来富集CTCs，是唯一获得FDA批准用于乳腺癌、前列腺癌和结肠癌中CTCs计数的方法。然而，CellSearch的应用受到一些限制的阻碍，例如由于良性和炎症性病变导致的假阳性，以及由于EpCAM阴性CTCs导致的假阴性。与CellSearch相比，ISET基于细胞直径富集CTCs，可能具有更高的CTCs检出率，但特异性较低。当较大的白细胞被错误捕获时，可能会出现假阳性。一项头对头比较显示，这两种方法之间的一致性较低，检出率分别为69%和88%，平均数量分别为0.9个/毫升和4个/毫升。由于这两种方法的局限性，新兴技术被开发出来以提高CTCs检测方法的准确性，例如添加更多抗体来捕获CTCs，设计纳米材料来提高捕获效率，或使用特定的腔室结构进一步富集CTCs。例如，一项研究使用血管内磁线通过体内注射的磁性颗粒标记来检索稀有生物标志物，其捕获效率比CellSearch高500-5000倍。

CTCs用于肺癌诊断的性能已被广泛研究。一项包含8项研究、1601名患者的荟萃分析显示，CTCs区分肺癌患者与良性患者和健康志愿者的汇总敏感性和特异性分别为75%和89%。最近一项研究使用集成锥形微滤器的微流控技术检测CTCs，在45名包括肺癌、癌前病变或良性病变及健康参与者中实现了81.8%的敏感性和90.5%的特异性。此外，通过单细胞或CTCs簇的形态学分析，CTCs可用于区分恶性肿瘤和良性结节。一项观察性研究中，从恶性（n=60）和良性（n=17）肺病变患者的外周血中分离出CTCs，并形态学分类为恶性细胞、不确定恶性细胞和良性细胞，其敏感性和特异性分别为89%和100%。除了CTCs，CTCs簇（定义为血液中发现的具有更高转移能力的两个或更多聚集的CTCs）也被探索。与CTCs相比，在一项包括29名肺癌患者、31名有或无良性肺结节的高危受试者和20名健康对照的研究中，CTCs簇在非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）患者中的敏感性较低（41.4% vs. 100%），但在有或无良性肺结节的高危受试者（特异性100% vs. 41.9%）和总体非癌受试者（特异性100% vs. 64.7%）中特异性更高。这些结果证明了CTCs和CTCs簇在区分恶性与良性结节方面的潜在效用。

然而，将CTCs用于肺癌筛查尚未成熟。CTCs检测的不一致标准和综合评价体系，以及在类似研究中报告的不理想性能，可能会阻碍CTCs的应用。进一步的分子分析或单细胞测序可能有助于确定分离细胞的恶性或良性属性，从而进一步提高CTCs在肺癌筛查中的性能。

循环肿瘤DNA（ctDNA）突变

细胞游离DNA（cfDNA）是通过细胞坏死或凋亡释放到体液中的DNA。循环肿瘤DNA（ctDNA）可以从原发性癌组织、CTCs或转移灶释放，其释放受肿瘤位置、肿瘤负荷和细胞增殖状态的影响。代谢肿瘤负荷越大，血管分布越密集，肿瘤细胞增殖活性越高，释放的ctDNA就越多。由于ctDNA来源多样，其往往高度片段化（35-10,000 bp）。ctDNA的常见大小为180 bp，它是由凋亡肿瘤细胞中 caspase激活的DNA酶消化染色质后释放的。

DNA突变通常发生在肿瘤细胞中，因此检测ctDNA中的突变可能提供一种检测癌症的方法。覆盖肺癌常见驱动基因（如EGFR、TP53、KRAS等）的Panel可能能够检测肺癌。然而，考虑到早期肺癌中ctDNA突变的等位基因频率可能低至0.0008%，如何提高检测限（Limit of Detection, LOD）以从基线噪声中区分稀有的ctDNA突变信号是肺癌筛查的主要挑战。

分析准确性取决于分析灵敏度、样本量、输入分子量和肿瘤分数。实际LOD受到样本制备、测序本身或测序过程中基线噪声所产生误差的限制。为了提高靶向测序的分析灵敏度，独特分子标识符（Unique Molecular Identifier, UMI）被应用，这是一种直接连接在文库DNA片段两端的独特分子条形码，有助于生物信息学比对来自同一DNA片段的序列，并最大限度地减少人为错误。癌症深度测序个性化分析（Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing, CAPP-Seq）结合双链UMI可以将肿瘤源性DNA的检测灵敏度降至0.00025%。通过这种方式，在验证集（n=40）中，100%的II-IV期NSCLC和50%的I期NSCLC可检测到ctDNA，特异性为96%。

基于ctDNA突变早期检测肺癌的另一个混杂因素是克隆性造血（Clonal Hematopoiesis, CHIP）。由于CHIP，体细胞突变可以在外周血细胞中检测到，这在老年参与者中更为常见（发生在65岁以上参与者的5.7%中）。最小化CHIP干扰的一种方法是以相当的深度对匹配的白细胞进行测序。在DETECT-A研究中，通过对490名基线阳性结果参与者中的匹配白细胞进行测序，鉴定出总共211例由CHIP导致的假阳性。与肿瘤源性突变相比，克隆性造血通常发生在较长的cfDNA片段中，并且缺乏与吸烟相关的突变特征。因此，通过将此特征与其他分子特征整合，一个名为“血浆中肺癌可能性”（Lung cancer likelihood in plasma, Lung-CLiP）的机器学习方法可以稳健地区分早期肺癌患者和风险匹配的对照。在验证集中，特异性为98%，I期、II期和III期的敏感性分别为41%、54%和67%。

当前基于ctDNA突变的肺癌筛查方法通常具有高特异性但敏感性较差。未来的研究需要进一步提高早期肺癌的敏感性。

细胞游离DNA（cfDNA）甲基化

DNA甲基化可以调节基因表达和细胞内环境以维持细胞功能。CpG二核苷酸中胞嘧啶C5位点的甲基化是表观基因组最稳定的组成部分，可受遗传和非遗传因素修饰，称为CpG岛，其在癌症发展过程中常常发生低甲基化。在原发性NSCLC患者中，基因甲基化的发生率高达96%。甲基化改变在肺癌中比基因突变发生得更早，使其更有利于早期筛查。与肺癌相关的甲基化基因已被深入研究，包括RASSF1A、p16、EGLN2、SETDB1和LRRC3B，这些基因在肺癌中起重要作用甚至影响预后。与突变相比，甲基化不易受克隆性造血的影响。此外，可追踪的癌症相关CpG位点数量可达数百万，显著超过仅数百个的基因突变，这意味着甲基化测序所需的深度较低。因此，除了ctDNA突变，甲基化是当前研究肺癌筛查的另一个生物标志物。

甲基化检测方法包括亚硫酸氢盐测定法、酶测定法和亲和法。虽然全基因组亚硫酸氢盐测序（Whole Genomic Bisulfite Sequencing, WGBS）仍然是“金标准”，但基于NGS的甲基化测序Panel因其成本更低、测序深度更高而更具临床应用潜力。然而，亚硫酸氢盐转化后DNA的低回收率是基于亚硫酸氢盐方法的一个问题，需要大量的DNA输入。为了解决这个问题，已经开发了多种新型cfDNA甲基化检测方法，可以富集更多甲基化DNA片段或加深甲基化组覆盖度。例如，细胞游离甲基化DNA免疫沉淀和高通量测序（cell-free methylated DNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing, cfMeDIP-seq）通过无亚硫酸氢盐程序实现了低DNA输入，而增强线性碎片扩增测序（enhanced linear-splinter amplification sequencing, ELSA-seq）构建了单链文库并将邻近CpG位点整合为甲基化单倍型块以提高检测准确性。分别仅需要1-10 ng或500 pg的输入DNA来捕获甲基化信号，这显著低于传统技术，如简化代表性亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS）或WGBS（100-2000 ng）。

cfDNA甲基化用于肺癌筛查的性能已被广泛研究。研究人员分析了308名可手术肺癌患者和261名年龄性别匹配的非癌对照者血液样本中的80,672个CpG位点，以识别肺癌特异性甲基化特征。检出率随肿瘤分期增加而增加，从IA期到III期，敏感性为52-81%，总体特异性为96%。在该研究中，亚组分析显示cfDNA甲基化检测出的病例数几乎是超深度突变测序分析所识别病例数的两倍。Hu等人研究表明，包括HOXB4、HOXA7、HOXD8、ITGA4、ZNF808、PTGER4和B3GNTL1在内的7个差异甲基化基因与肺癌高度相关。该模型在独立验证队列中区分肺癌患者与对照（包括良性肺病和健康对照）时，曲线下面积（AUC）为0.94，敏感性为0.81，特异性为0.98，准确度为0.93。最近，几项研究表明基因低甲基化也可用于预测早期肺癌。FUT7和RPTOR的低甲基化在发现和验证队列中被证明与早期肺癌相关。然而，FUT7和RPTOR低甲基化在肺癌筛查中的性能尚未得到评估。

与ctDNA突变类似，通过cfDNA甲基化检测肺癌严重依赖于ctDNA的释放，因此早期肺癌的敏感性暂时不理想。在第二项预先指定的CCGA子研究中，基于cfDNA甲基化的早期检测分类器在肺癌中，I期敏感性仅为23.0%，II期为47.0%，特异性为99.0%。在第三项CCGA验证子研究中，早期检测分类器在肺癌中显示I期敏感性为21.9%，II期为79.5%，特异性为99.0%。此外，另一个cfDNA甲基化早期检测模型在肺癌I期显示出相似的敏感性（27.5%），特异性为98.9%。基于甲基化的分类器可能无法检测到主要由基因突变驱动的癌症，例如主要由EGFR L858R突变、EML4-ALK融合或ERBB2扩增驱动的肺癌亚型。未来的努力需要提高cfDNA甲基化在肺癌中的敏感性。

细胞游离DNA（cfDNA）片段化

近年来，人们对癌症患者cfDNA片段化谱的兴趣日益增长。健康个体的cfDNA片段化与淋巴细胞核小体DNA片段化谱和核小体距离高度相关，而癌症患者的cfDNA长度则更多变，这可用于癌症检测。

基于全基因组片段化谱，构建了一个机器学习模型（DNA evaluation of fragments for early interception, DELFI）来区分癌症患者和健康个体。该模型以98%的特异性区分多种癌症（乳腺癌、结直肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌或胆道癌，n=236）与健康个体（n=245），敏感性范围从59%到99%。所有肺癌患者（n=12）均被检测出。基于DELFI，在46名肺癌患者和385名非癌患者（包括良性结节、已康复的肺癌患者、其他肺部疾病患者和健康个体）中构建了一个结合片段谱、临床风险因素和CEA水平的分类模型（DELFImuti）。该模型以80%的特异性成功检测出94%的肺癌患者。另一项近期研究报道，在训练队列（113名患者；113名对照受试者）中构建的堆叠集成模型，整合了来自血浆cfDNA全基因组测序（WGS）数据的五种片段组学特征，包括拷贝数变异、片段大小覆盖度、片段大小分布、6-bp末端基序和6-bp断点基序，在队列验证III中区分早期NSCLC患者与对照时显示出92.5%的高敏感性和94.2%的特异性。总之，这些研究证明了cfDNA片段化在肺癌早期筛查中的潜力。

然而，cfDNA片段化在肺癌检测中具有与cfDNA甲基化相似的局限性，例如由生理和其他病理因素引起的假阳性率，或由于技术限制导致的假阴性率。由于靶向测序分析的位点数量有限，WGS主要用于分析cfDNA片段化的额外异常。WGS应用于肺癌筛查的可行性可能受测序深度的影响。低深度WGS无法充分利用片段化细节和患者的组织贡献，而高深度WGS成本过高，这可能是其临床应用的主要限制。cfDNA片段化在肺癌筛查中的应用仍需更多证据。

微小RNA（miRNAs）

微小RNA（miRNAs）是短的（通常为18-25个核苷酸）、单链、高度保守的非编码RNA。它们可以通过与靶标mRNA的非翻译区结合来调节基因表达，导致mRNA降解或翻译抑制。通过介导转录后基因沉默，miRNAs在肿瘤发生、进展和转移中发挥重要作用。例如，miR-34参与调节p53表达，从而导致肺癌细胞凋亡。肿瘤相关miRNAs可通过外周循环（循环miRNAs）或外泌体（外泌体miRNAs）检测。循环miRNAs包含由特定免疫细胞激活/抑制或细胞相互作用介导的额外信息。外泌体miRNAs由于囊泡封装比循环miRNAs更稳定，但样本处理更为复杂。

miRNAs的传统检测方法主要包括Northern印迹、微阵列和逆转录聚合酶链反应，这些方法在研究实验室中广泛应用，但存在灵敏度差、试剂昂贵和通量低等局限性，不适用于肺癌筛查。已经开发出具有高灵敏度和特异性的新方法，例如物理和化学模板阻断策略、靶标引发滚环扩增策略和酶辅助靶标循环策略，以克服生物体液中miRNA低丰度带来的前沿挑战。例如，通过使用钴氧氢氧化物纳米薄片和己二醇化学修饰来阻断指数扩增反应中的非特异性模板延伸，可以在500 pM至5 fM的至少六个数量级范围内建立线性关系，这可以涵盖癌症筛查中循环miRNA的浓度范围。新技术的出现为miRNA在肺癌检测中的应用提供了更多可能性。

在一项多中心队列研究中，对3046名参与者（包括肺癌、良性肺病、非肺病或健康对照）的血液样本进行了全基因组miRNA分析。miRNA特征以93.5%的特异性区分肺癌患者与非癌症患者，敏感性为82.8%。另一项包括314名个体（肺癌患者和匹配对照）的队列研究表明，五种miRNAs（miR-320a-3p、miR-210-3p、miR-92a-3p、miR-21-5p和miR-140-3p）在病例中显著高于对照，AUC值分别为0.57-0.62。由于外泌体miRNA包含更丰富的肿瘤信息，Jin等人从46名早期肺癌患者血浆中分离并分析肿瘤源性外泌体，以研究外泌体miRNA谱在肺癌检测中的性能。验证了三个用于检测NSCLC、腺癌和鳞状细胞癌（SCC）的Panel，其AUC值分别为0.899、0.936和0.911。上述研究显示了miRNAs作为肺癌筛查生物标志物的潜力。

然而，由于不同的检测平台和标志物，miRNA在肺癌筛查中的检测效能仍存在疑问。一项整合了288篇相关文章（包括16,697名肺癌患者、12,582名健康对照和892名良性肺病患者）的荟萃分析揭示，某些miRNAs在肺癌患者血液和肿瘤组织样本中的表达模式存在矛盾。这些不一致性削弱了这些miRNAs作为肺癌筛查生物标志物的可靠性。例如，据报道miR-145在血液样本中上调，但在肿瘤样本中下调。此外，miRNAs的表达可能因肺癌的不同阶段而异。例如，已知在肺癌患者中过表达与较差预后相关的miR-19a，在I期和II期肺癌患者中发现下调，但在III期上调。此外，另一项包含20项研究、598名肺癌患者和528名健康受试者的荟萃分析确定了15种不同的miRNAs。有趣的是，只有5种miRNAs与前述研究重叠。观察到的不一致性可能归因于研究对象、样本来源和测序技术的差异。为了确立miRNAs作为生物标志物的预测有效性，通过机制研究和前瞻性临床研究进行进一步验证是必要的。

肿瘤相关自身抗体（AAbs）

肿瘤相关抗原（Tumor-Associated Antigens, TAAs）的异常过表达或异位表达以及干细胞转录因子可导致自身抗体（AAbs）的产生。这些TAAs可被免疫系统识别和捕获，引发AAb的形成。大量研究探讨了不同AAbs组合在肺癌筛查中的临床价值。例如，一个五AAb Panel（SEC15L2、BAC克隆RP11-499F19、XRCC5和MALAT1）在测试集中达到了82.6%的敏感性和87.5%的特异性。另一个包含6种AAbs的Panel（IMPDH、磷酸甘油酸变位酶、ubiquillin、Annexin I、Annexin II、HSP70-9B）达到了94.8%的敏感性和91.1%的特异性。Ren等人验证了另一个7-AAb Panel（p53、GAGE7、PGP9.5、CAGE、MAGEA1、SOX2和GBU4-5）用于肺癌早期检测的临床价值。其敏感性和特异性分别为61%和90%（311名肺癌患者，229名对照）。另一个7种AAbs Panel（p53、c-myc、HER2、NY-ESO-1、CAGE、MUC1和GBU4-5）用于肺癌检测的敏感性为76%，特异性为92%。

AAbs在区分良恶性结节方面也进行了研究。在一个包含1,987名肺结节患者的大型临床队列中，将包含七种AAbs的分类器添加到LDCT中，提高了诊断性能，具有高特异性（>92%）和阳性预测值（PPV）（>