基于深度学习的直肠癌免疫微环境空间异质性自动量化与无病生存预测新方法

《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Automatically quantifying spatial heterogeneity of immune and tumor hypoxia environment and predicting disease-free survival for patients with rectal cancer

本研究针对传统免疫组化(IHC)分析在肿瘤微环境评估中存在的劳动强度大、主观性强等局限性，开发了一种集成深度学习肿瘤分割与DAB染色定量分析的自动化流程。研究人员通过对104例直肠癌患者CD3、CD8、CD31和HIF-1α染色样本的分析，首次发现肿瘤侵袭前沿外缘0.25mm区域的CD3/CD8阳性区域密度和0.75mm区域的HIF-1α阳性区域密度具有显著预后价值。这些特征与pTNM分期联合使用时，将DFS预测的C-index从0.668-0.702提升至0.853-0.819，为直肠癌精准预后评估提供了新的技术路径。

在当今肿瘤治疗领域，直肠癌作为威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，其治疗策略的优化始终是临床研究的重点难点。尽管放化疗等传统治疗手段能显著降低局部复发风险，但患者间的治疗反应存在显著异质性，部分患者仍面临复发转移的困境。更令人困扰的是，现有TNM分期系统难以准确预测个体化治疗反应，这促使研究人员将目光投向肿瘤微环境这一关键领域。

肿瘤免疫微环境中的细胞毒性T细胞已被证实与良好预后相关，而基于CD3⁺和CD8⁺T淋巴细胞的免疫评分(Immunoscore, IS)更是被部分指南推荐用于直肠癌治疗管理。与此同时，肿瘤缺氧微环境作为治疗抵抗和不良预后的重要指标，其核心调控因子HIF-1α（缺氧诱导因子1α）的上调与肿瘤侵袭转移密切相关。然而，传统免疫组化分析方法的局限性——劳动强度大、耗时长、存在主观差异——严重制约了这些生物标志物的临床转化应用。

针对这一瓶颈问题，复旦大学附属肿瘤医院沈伦陈与刘宗林等研究人员在《Cancer Immunology, Immunotherapy》发表了一项创新性研究，开发了一套基于深度学习的自动化分析流程，实现了对直肠癌免疫和缺氧微环境空间异质性的精准量化。

研究团队首先建立了结直肠癌肿瘤区域识别模型，通过卷积神经网络（CNN）对256×256像素的图块进行分类训练。该模型采用ResNeXt-101-32x8d架构，在验证集上区分肿瘤与非肿瘤区域的曲线下面积（AUC）达到0.975，淋巴细胞识别AUC为0.994，其他非肿瘤细胞识别AUC为0.974，展现出卓越的分类性能。

在肿瘤区域精准识别的基础上，研究团队定义了五个不同的感兴趣区域（ROI）集群：肿瘤主体区域、向内侵袭边缘、向外侵袭边缘、双侧侵袭边缘以及肿瘤主体结合向外侵袭边缘区域。通过形态学操作，他们在不同距离尺度上（0.25mm至3.00mm）精确划分这些区域，为后续空间异质性分析奠定基础。

染色定量分析环节，研究人员采用颜色反卷积算法分离苏木精和DAB染色信号，通过固定阈值（0.02）生成DAB阳性区域二值化掩模，并利用形态学分割进行细胞计数。对于CD31免疫染色，由于其非细胞定位特性，研究仅进行面积量化而未进行细胞计数。

研究纳入了104例未接受新辅助治疗的直肠腺癌患者术后标本，随机分为训练集（57例）和验证集（47例）。通过单变量Cox比例风险回归分析，研究人员发现传统免疫评分定义区域（肿瘤主体结合向外侵袭边缘）的特征并未显示出统计学显著性。取而代之的是，向外侵袭边缘0.25mm区域的CD3/CD8聚合阳性区域面积（IS_areas_outer_invasive_margin_0.25）表现出显著预后价值（HR=0.29，95% CI：0.10-0.87，p=0.044）。

肿瘤免疫微环境特征选择

深入分析显示，CD3⁺细胞在多个ROI中均呈现显著预后特征，其中肿瘤主体结合向外侵袭边缘区域（集群5）预测性能最优（C-index=0.740训练集，0.730验证集）。相比之下，CD8⁺细胞的显著特征分布在三个不同ROI中，双侧侵袭边缘区域（集群4）表现出最佳预测能力（C-index=0.693训练集，0.778验证集）。这种空间异质性提示不同免疫细胞亚群可能需要特定的区域评估策略。

肿瘤缺氧微环境特征选择

CD31特征与DFS无显著关联，而HIF-1α在双侧侵袭边缘区域（集群3和4）的染色面积或细胞计数参数中显示出预后意义。通过比较评估，面积测量优于细胞计数（平均C-index 0.687 vs. 0.666），且集群3特征（C-index=0.687）优于集群4（C-index=0.694）。最终，向外侵袭边缘0.75mm区域的HIF-1α阳性区域面积（HIF1-α_areas_outer_invasive_margin_0.75）被确定为最佳缺氧标志物（HR=1.38，95% CI：1.04-1.82，p=0.026）。

预后性能验证

IS_areas_outer_invasive_margin_0.25在训练集和验证集的C-index分别为0.726和0.626，而HIF1-α_areas_outer_invasive_margin_0.75相应为0.714和0.656。Kaplan-Meier曲线分析显示，IS特征在训练集中具有显著分层能力（log-rank p=0.035），而HIF-1α特征在验证集中呈现边缘显著性（p=0.077）。

多特征模型整合

多变量Cox回归分析构建的增强模型包含上述两个空间异质性特征，两者均保持独立预后意义：IS特征显示保护效应（HR=0.28，95% CI：0.083-0.91，p=0.035），HIF-1α特征呈现风险增强效应（HR=1.51，95% CI：1.16-1.93，p=0.002）。该模型在训练集和验证集的C-index分别达到0.857和0.763，显著优于单个特征。

与pTNM分期的协同作用

将空间异质性特征与pTNM分期整合后，仅增强模型保持独立预后价值（p=0.007）。IS特征将pTNM模型的DFS预测性能从C-index 0.702提升至0.800（训练集）和0.668至0.802（验证集），而增强模型则进一步提升至0.819（训练集）和0.853（验证集），相对提升幅度达17%-28%。

研究结论与讨论

本研究成功开发了一套自动化IHC分析流程，解决了传统方法在肿瘤微环境评估中的主要限制。通过深度学习驱动的空间异质性分析，研究人员不仅验证了已知免疫标志物的预后价值，还揭示了缺氧微环境特征在直肠癌预后预测中的重要作用。

值得注意的是，研究发现传统免疫评分定义区域并非最优评估区域，而特定距离的向外侵袭边缘区域可能提供更精准的预后信息。CD3⁺和CD8⁺细胞最佳评估区域的差异进一步强调了生物标志物特异性空间分析的的重要性。

对于缺氧微环境，研究结果提示肿瘤外侧侵袭边缘的缺氧状况可能比内侧区域更具生物学相关性，这与既往关于肿瘤侵袭前沿缺氧微环境促进肿瘤进展的研究一致。

研究的局限性包括手工设计特征未能充分考虑不同生物标志物间的相互作用、样本量有限以及缺乏外部验证。未来研究方向可探索自监督学习方法以识别更具预测力的特征，并通过多中心验证确认发现的普适性。

该自动化流程为标准化IHC-based预后评估提供了可行方案，其揭示的空间异质性特征不仅增强了现有分期系统的预测能力，也为个体化治疗策略的制定提供了新的生物学见解。随着技术的进一步完善和验证，这种方法有望在直肠癌精准医疗领域发挥重要作用。